科研 | Brief.Bioinformatics：综合组学分析揭示肥胖成人肠道微生物代谢产物的变化
编译：万佳宏，编辑：Emma、江舜尧。
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肥胖是现代社会中威胁健康的一个全球性问题，在世界成年人口中，肥胖症的患病率约为13％。肥胖可促进糖尿病、心血管疾病和癌症等非传染性疾病的发展。肠道微生物的组成和功能的改变被认为是代谢障碍的标志之一，最近有报道指出肥胖能影响肠道微生物的组成和正常功能，从而导致代谢紊乱相关。肠道微生物群的代谢产物具有多样性，并在宿主中发挥重要的生理作用，然而，目前对肥胖成年人肠道微生物群、肠道代谢物和宿主代谢物谱之间的关系仍缺乏系统的评估。
为了研究肠道微生物代谢产物与肥胖相关的代谢功能障碍的关联，作者通过16S rRNA来评估肠道微生物组成，并结合代谢组学分析确定了六名来自中国的正常成年人、肥胖成年人的肠道菌群和肠道宿主代谢产物。通过功能和通路富集分析，发现肠道菌群的变化可能导致肠道代谢产物的调节，从而促进了糖酵解，三羧酸循环和同型乳酸发酵。此外，代谢组学分析表明，肠道和宿主体内的代谢异常包括多种可导致肥胖和糖尿病等代谢性疾病的代谢物，如1-苯丙氨酸，1-酪氨酸，尿酸，犬尿酸，胆固醇硫酸盐和葡萄糖胺等。这项研究提供了肥胖成年人肠道微生物群代谢物与宿主代谢之间的可能联系，鉴定出的代谢物变化可作为评估肥胖和代谢异常的生物标志物，为研究肠道微生物代谢产物与肥胖相关的代谢功能障碍之间的关系提供了新的见解。
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实验设计
1.样本来源：招募了6名中国人类受试者，其中包括来自广西桂林市的3名肥胖成年受试者和3名正常成年受试者。选定的参与者经历了相同的环境因素，具有相似的卫生状况、饮食、污染和其他常见的生活方式特征。
2.肥胖成年人模型的评估：通过测量体重指数（BMI）了解受试者的肥胖状况，BMI18.5至<25代表正常，而BMI≥30.0则代表肥胖，同时采集正常和肥胖成年人的血液，并通过生化试验、酶联免疫吸附试剂盒测量样本中与肥胖有关的各种参数和标记，包括血浆胰岛素、成纤维细胞生长因子21、白细胞介素10、血浆中谷氨酸丙酮酸转氨酶（ALT），甘油三酸酯，总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。使用HOMA计算胰岛素抵抗（IR），公式为：HOMA =空腹血糖（nmol/ l）×胰岛素（µU/ ml）/22.5。通过稳态模型评估（HOMA-IR）指数评估接受测试的肥胖成年人模型。
3.16SrRNA分析：提取正常和肥胖成年人的粪便细菌进行了16S rRNA分析，了解肥胖成年人的肠道微生物组成变化。
4.粪便、血清代谢组分析：对正常和肥胖成年人的粪便、血清样本分别进行代谢组研究，对获得的代谢组学数据进行综合分析，了解肠道菌群和肠道宿主代谢物谱之间的相关性。
实验结果
1. 正常和肥胖成年人的血液参数
本研究使用BMI作为超重或肥胖的筛查工具，了解研究中肥胖成年人的状况并测量了受试者的BMI，检测了其血液样本中与肥胖有关的各种参数和标记（见表1）。BMI为18.5至<25代表正常，而BMI≥30.0则代表肥胖。并通过HOMA-IR指数对肥胖成年人模型进行评估，包括甘油三酸酯水平， LDL-C，HDL-C，空腹血糖（FBG），胰岛素，ALT和TC（表1）等。
结果显示，肥胖组的HOMA IR指数高达5.66±0.78，表明受测肥胖成年人的胰岛素抵抗显著（表1）。此外，肥胖组的LDL-C和TC含量较高，而HDL-C的含量较低（表1），进一步表明接受测试的肥胖成年人患心血管疾病的风险较高。这些数据表明接受测试的肥胖成年人是良好的研究模型。
表1 正常成年人与肥胖成年人的肥胖参数
2. 肥胖成人肠道微生物群的变化
为了了解肥胖成年人肠道微生物的组成变化，对正常和肥胖成年人的粪便样本进行了16S rRNA分析，每个样品中至少获得了1700万有效碱基，并使用操作分类单位（OTU）对微生物多样性进行分类。正常组（图1A）中识别了1035个OTU，肥胖组（图1B）中识别了989个OTU，其中两个组中共有862个OTU（图1C）。α多样性分析通过观测物种指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数对各样本物种多样性的复杂性进行分析。稀疏曲线的平展表明测序数据覆盖群落中的所有细菌种类（图1D）。然而，在正常成年人和肥胖成年人之间，肠道细菌种类多样性的差异不显著（图1D）。但对正常成人和肥胖成年人粪便微生物群落的比较分析表明，肥胖成年人的梭菌类显著减少（表2）。此外，在肥胖的成年人的肠道中变形菌类、理研菌科、巴斯德氏菌科（图2A、B和表2）、Alistipes和嗜血杆菌属（图2C和表2）等微生物群落均存在一定程度地减少。并且在种属水平上，与正常成年人相比，肥胖成年人中的Allopretella、毛螺菌科、嗜胆菌属和Burkholderales存在显著富集(图2C和表2)。通过重建未观察到的状态（PICRUSt）进行系统发育研究来预测肥胖成年人中观察到的微生物组变化的潜在功能作用，PICRUSt分析表明糖酵解(糖酵解I （P= 0.044）、糖酵解II（P= 0.02））、三羧酸（TCA）循环（P= 0.031）和同乳酸发酵（P= 0.04）发生功能改变(表3)。
图1 不同分组的肠道微生物菌群多样性
A：正常成年人常见的OUT；B：肥胖成年人常见的OUT；C：正常和肥胖成年人常见的OUT；D：Alpha多样性分析，包括物种观察、Chao1、Shannon和Simpson指数。
图2 肥胖成年人与正常成年人肠道菌群的变化
不同分组样本在（A）目、（B）科、（C）属水平上的分类组成
表2 肥胖成年人肠道微生物群的显著变化
3. 粪便代谢组变化
基于LC-MS的代谢组学方法，肥胖成年人代谢组学分析获得了14610个具有正离子模式（PIM）和12540个负离子模式（NIM）的代谢物（表4），使用人体代谢组数据库（HMDB）对获得的数据进行分析，分别注释了7370个具有PIM特征、5468个具有NIM特征的样本（表4）。在HMDB超类分析中，PIM（图3A）和NIM（图3B）中含量最高的代谢产物为脂质分子，肥胖和正常成年人粪便代谢产物具有明显的差异（图3C）。在MS1分析中，肥胖成年人与正常成年人相比， PIM鉴定出1913个异常代谢物（797上调和1116个下调的代谢物）（图3D和表2），NIM鉴定出1288个异常的代谢物（532上调和756个表达下调代谢物)）（图3E和表3）。
图3 肥胖成年人与正常成年人肠道代谢物的变化
A、B：粪便代谢物中鉴定的PIM和 NIM；C：肥胖成年人与正常成年人粪便代谢组中PIM和NIM的差异代谢物；D、E：正常成年人与肥胖成年人粪便中PIM和NIM差异代谢物的火山图
表3 PICRUSt分析微生物菌群变化引起的功能改变
表4 粪便代谢组的统计分析
为了阐明粪便代谢物的改变与肥胖成年人代谢紊乱之间的相关性，通过KEGG通路富集分析肥胖成年人代谢通路与次生代谢物生物合成之间的密切联系。KEGG通路分析显示，在肥胖成人中，代谢通路与次生代谢物的生物合成密切相关（图4A）。受影响的代谢途径包括组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和脂肪酸代谢（图4A）。其中多种脂肪酸代谢通路显著富集，如花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延伸和降解（图4B）。此外，肥胖成人粪便中的葡萄糖代谢，包括半乳糖、果糖、甘露糖、淀粉和蔗糖代谢也发生了改变（图4B）。总的来说，这些数据与肥胖成年人肠道菌群的变化一致。
图4 肥胖成年人肠道代谢紊乱的功能分析
A：肥胖成年人粪便代谢组的KEGG富集散点图；B：肥胖成年人中PIM和NIM差异代谢物的数量
4. 肥胖成年人的血清代谢变化
血清比较代谢组学分析结果显示，正常成年人与肥胖成年人的血清代谢组获得12419个PIM和14134个NIM的代谢物（表5）。MS1分析中确定了6354和5452个独立样本分别属于PIM和NIM （表5），在HMDB超类分析中，含量最高的代谢物是PIM（图5A）和NIM（图5B）中的脂质分子。此外，肥胖和正常成年人之间的血清代谢产物图谱比较显示出显著差异(图5C)。PIM鉴定出384个异常代谢产物（包括127个上调和257个下调）（图5D），而NIM鉴定出498个异常代谢产物（包括339个上调和159个下调）（图5E）。对异常代谢产物进行KEGG通路富集分析，与粪便代谢组学分析一样，肥胖成年人体内的代谢通路也发生了改变（图5F），表明肠道微生物代谢产物与宿主血清代谢产物之间可能存在相互作用。另外，初级胆汁酸的生物合成、花生四烯酸代谢和产生IgA的肠道免疫网络也受到干扰（图5F）。
表5 血清代谢组的统计分析
图5 肥胖成年人与正常成年人血清代谢物的变化
A、B：血清代谢物中鉴定的PIM和NIM；C：肥胖成年人与正常成年人血清代谢组中PIM和NIM的差异代谢物；D、E：正常成年人与肥胖成年人血清代谢组中PIM和NIM差异代谢物的火山图；F：肥胖成年人血清代谢组的KEGG富集散点图
5. 粪便、血清的综合代谢组学分析
对粪便和血清样本中获得的代谢组学数据进行了综合分析，以了解肠道微生物群和肠道-宿主代谢产物谱之间的相关性。确定了肥胖病人的粪便和血清样本中的25个异常表达的代谢物，包括11个上调和14个下调代谢物（表6），如l-苯丙氨酸，酪氨酸，尿酸，犬尿酸、胆固醇硫酸氨基葡萄糖等。结果表明肥胖成年人的血清和粪便代谢产物存在一致的失调，而这些失调与肠道微生物群的改变所导致的功能改变一致。
表6 肥胖成年人血清和粪便样本中的差异代谢物
讨论
肠道微生物群组成和功能的改变是代谢损伤的特征之一。在人类和动物模型中进行的多项研究表明，肠道菌群对各种代谢特征和功能障碍（如肥胖和胰岛素抵抗）有重要影响。肠道微生物群可以将淀粉发酵成具有生物活性的代谢物，包括SCFAs，如乙酸、丁酸盐等。代谢疾病可由能量摄入和消耗之间的不平衡引起。流行病学和实验室研究报告显示，肠道微生物依赖代谢物的能量收集作用，如短链脂肪酸（SCFAs），与代谢综合征的发展密切相关。因此，肠道代谢物被认为是连接肠道微生物群与代谢综合征的主要成分。尽管已知肠道菌群对宿主代谢产物水平的影响，但肥胖个体肠道菌群、肠道代谢产物与宿主代谢之间可能存在的相关性仍是有限的。
1. 16SrRNA分析
在本研究中，16SrRNA分析发现肥胖成人的梭菌类显著减少，变形菌类、理研菌科、巴斯德氏菌科、Alistipes和嗜血杆菌属等微生物群落也存在不同程度的减少。梭菌类包含约250种细菌，是肠道微生物的重要组成，梭菌的定植可促进肠道吸收脂肪，减少肥胖；而变形菌作为一种革兰氏阴性细菌，主要包含硫酸盐还原菌，是一种人类肠道菌群中的主要细菌，在大鼠和克罗恩氏病中，高脂饮食已显示会改变其丰度，从而暗示其在代谢异常存在一定作用；理研菌科细菌存在多种不同动物的消化道中，已研究表明肥胖成年人与正常成年人相比，其理研菌科和巴斯德氏菌科细菌的丰度较低，而理研菌科的相对丰度降低与钙卫蛋白水平有关，并且可导致嗜中性粒细胞向肠粘膜迁移，因此，其丰度降低可能与结肠炎症相关。
而PICRUSt分析预测，糖酵解、TCA发生功能改变。糖酵解和三氯乙酸循环是葡萄糖稳态的重要生物学过程和能源支出。糖酵解主要调节胰岛素分泌和多种细胞的功能代谢，尤其是肝细胞，并且糖酵解的改变与肥胖相关，已有研究表明肝糖酵解的增强可减少肥胖小鼠的体重，缓解肥胖；而在高脂饮食小鼠模型中，其肝脏TCA循环（末端脂肪氧化和糖异生）升高，在诱导肥胖小鼠的白色脂肪组织中，TCA循环的代谢物增加。在本研究中，肥胖成年人的肠道菌群中TCA循环代谢物水平降低，导致差异的原因可能是由于肥胖患者中TCA循环酶的失调。综上所述，这些数据均提示肥胖成年人肠道菌群的改变可能与宿主代谢的改变有关。
2. 粪便代谢组分析
在HMDB超类分析中，PIM和NIM含量最高的代谢产物为脂质分子，而KEGG通路分析显示，在肥胖成人中，受影响的代谢途径主要包括组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和脂肪酸代谢，其中多种脂肪酸代谢通路显著富集。
粪便样本中存在脂质或脂肪可能是由于肠道微生物群产生的SCFAs被肠道吸收，经粪便排泄。SCFA的大量排泄与多种健康问题相关，如过度肥胖和代谢疾病。而组氨酸是一种主要从日常摄入的蛋白质中获得的氨基酸，可用于代谢能生产，约占代谢能生产的15%，而另一方面，组氨酸还可以通过糖异生来生产葡萄糖。因此，组氨酸代谢的改变可能导致能量和葡萄糖稳态的失衡。苯丙氨酸作为一种必需氨基酸，可通过苯丙氨酸羟化酶转化为酪氨酸，而血清苯丙氨酸水平与肥胖显著相关，其中苯丙氨酸与高甘油三酯血症风险的相关性较高。
3. 血清代谢组分析
对正常成年人与肥胖成年人的血清代谢组进行比较分析，肥胖成年人除了体内的代谢通路发生改变，其初级胆汁酸的生物合成、花生四烯酸代谢和产生IgA的肠道免疫网络也受到干扰。胆汁酸是在肝脏中合成的甾体酸，参与脂肪代谢，如脂肪的消化和吸收；胆汁转移与肠道微生物群的变化有关，并可通过改善血糖和脂质稳态显著减轻体重；此外，花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸，存在于质膜的磷脂中，在营养代谢中发挥作用，从而参与代谢疾病如肥胖和糖尿病的发展，并且已有研究表明脂肪组织花生四烯酸与BMI和超重状况之间存在正相关关系。
4. 综合代谢组学分析
对粪便和血清样本中获得的代谢组学数据进行了综合分析，确定了肥胖病人的粪便和血清样本中的25个异常表达的代谢物，包括l-苯丙氨酸，酪氨酸，尿酸、胆固醇硫酸氨基葡萄糖等。l-苯丙氨酸参与能量摄入，补充苯丙氨酸可促进全身脂肪氧化，调节肠道激素释放；而l-酪氨酸与人类的肥胖、胰岛素抵抗有关；尿酸是尿液的主要成分，血清尿酸水平是评价肥胖、糖尿病等代谢紊乱的一个指标，也是代谢综合征、糖尿病和高血压的重要生物标志物，尿酸水平高的人更容易患代谢综合征和糖尿病；此外，有研究证实了胆固醇硫酸盐、葡萄糖胺和肾上腺酸与肥胖的相关性，胆固醇硫酸酯通过抑制乙酰辅酶A合成酶的表达来抑制糖异生，葡萄糖胺在临床上可用于抗炎、清除自由基和抗肥胖。
评论
目前的大多数研究仅针对肥胖者的肠道微生物代谢物或血清代谢物，但没有系统的研究报告肠道微生物代谢物与宿主血清代谢物之间可能的关联。尽管本研究中发现的血清和粪便代谢产物之间的因果关系还需要通过无菌小鼠模型进一步证实。但本文为这种重要的相关性研究提供了一种新颖的见解。本研究中发现的肠道微生物组和肠道宿主代谢物的失调，可以通过更大的肥胖患者样本量进一步证实，从而得出结论。综上所述，本研究通过肠道代谢物的变化来评估肠道菌群对宿主代谢物的可能影响，揭示肠道菌群的变化可能影响肠道和宿主的代谢物，导致肥胖、糖尿病等代谢紊乱。这项研究的发现，列举代谢物的变化，可以扩大作为生物标志物的肥胖和代谢紊乱。