Cell丨快速和复杂的亚细胞动力学：微秒级3D动态可视化
撰文：珍奇
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推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1. 扫描光场显微镜可实现毫秒级的3D亚细胞成像
2. DAO通过紧凑系统促进了高速像差校正
3. 层析成像可实现长期快速的低光毒性活体成像
4. DAOSLIMIT详细观察了哺乳动物的迁移小体生物发生和动力学
哺乳动物的长期亚细胞活体成像对研究天然生理过程中多种细胞间行为和细胞器功能至关重要。然而光学异质性、组织不透明性和光毒性等问题对该技术提出了巨大的挑战。2021年5月25日，清华大学自动化系戴琼海课题组及清华大学生命科学学院俞立课题组，在《Cell》杂志上合作发表了一篇名为“Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale”的研究论文，该研究提出了一种数字自适应光学扫描光场相互迭代层析成像（DAOSLIMIT）技术，它具有高速、高分辨率3D成像、平铺波前校正和紧凑型系统低光毒性的特性。借助该技术，他们还研究了中性粒细胞迁移和肿瘤细胞循环过程中不同物种的大规模细胞迁移和神经活动，并观察了哺乳动物的各种亚细胞动力学。
为了平衡空间分辨率和角度分辨率，他们首先使用2D振镜系统定期扫描图像平面，该系统以时间分辨率为代价在相邻微透镜之间提供了空间重叠。相对于每个微透镜中心的相对位置相同的传感器像素属于相同的角度分量，可以在非负约束条件下将其重新实现高分辨率3D重建。此外，由于在不同分段孔径上的线性相位调制对应于角度分量的空间偏移，他们不仅可以根据角度测量之间的差异来估计空间非均匀像差，还可以通过数字移动角度图像来校正像差，称此过程为DAO。接着，为了评价DAOSLIMIT在不同条件下的分辨率，他们用油浸物镜对不同样品进行成像。随后，他们用3×3和13×13扫描对微管标记的MCF10A细胞进行成像，结果显示了具有330 nm横向间隔和440 nm轴向间隔的相同可区分结构。
哺乳动物中最新的亚细胞IVM仅能捕获焦点对准的2D信息，而对焦点失焦的平面造成不必要的热损伤，从而限制了高成像时间速度。相反，DAOSLIMIT具有DAO功能，可同时对整个激发体积进行固有成像，以改善多细胞环境中的分辨率和SNR。为了通过实验比较DAOSLIMIT的成像性能和光毒性与共振扫描双光子显微镜和SDCM的成像性能和光毒性，他们建立了小鼠活体成像系统，以此对脾脏和肝脏中的中性粒细胞进行成像。在静脉注射荧光偶联的Ly-6G / Ly-6C（嗜中性粒细胞标记物）抗体和血管染料后，将小鼠麻醉并解剖以暴露脾脏，以便通过不同的显微镜进行成像。与双光子显微镜和SDCM相比，DAOSLIMIT没有明显的漂白现象，且在连续成像中，其功率密度的五分之一以3倍的速度（3体积/秒）的速度提高了10倍。即使捕获了成千上万的体积，也只观察到轻微的漂白现象。
免疫细胞的体内细胞动力学已经通过双光子显微镜进行了很好的研究，但是由于时空分辨率低和细胞器对光剂量的敏感性低，因此大规模，快速和复杂的亚细胞动力学仍然很少被理解和研究。但是，由于其体积小（0.5–2 mm）和3D运动性高，很难在体内显示出微粒体的动态，这限制了他们对其在哺乳动物中的功能的理解， DAOSLIMIT恰好填补了这一空白。借助之前描述的小鼠活体成像系统，DAOSLIMIT揭示了中性粒细胞在小鼠肝脏的脉管系统迁移过程中通过附着在血管上而附着在血管上，从而在回缩纤维生成后中性粒细胞快速移动并产生了微粒体。与双光子显微镜和SDCM相比，DAOSLIMIT显示出更好的时空分辨率和低光毒性，这对于清楚地捕获小鼠中的微粒体生物发生的整个过程是必不可少的。他们还观察到表面膜蛋白Ly-6G逐渐富集于微粒体中，表明了微粒体的生长过程。此外，实验结果表明中性粒细胞可以通过循环的微粒体传递信号并与长距离免疫细胞通讯，并增强免疫监视系统。
体内3D细胞迁移的另一个经典示例是肿瘤转移。从原发肿瘤中产生后，单个或一组浸润性癌细胞会侵入脉管系统，从而使循环肿瘤细胞（CTC）传播到远处和种子转移菌落。CTC作为个体或簇在血管中移动，并不断受到免疫细胞和血流切应力的攻击，这涉及快速而复杂的大规模细胞或亚细胞动力学。尽管在癌症研究和治疗方面取得了重大进展，但由于缺乏先进的成像技术以及长期的体内足够的时空分辨率，因此转移仍然是癌症生物学领域最鲜为人知的方面。
为了观察转移的动力学，他们使用了移植模型，将稳定表达膜定位的PH-mCherry的乳腺癌细胞注入转基因斑马鱼Tg的脉管系统中。使用DAOSLIMIT，他们观察到癌细胞到达血管之前的血管扩张和血管被血流冲走后的血管收缩。当癌细胞进入的血管时，一些个别的癌细胞在循环时被困在小口径微血管中。值得注意的是，被捕获的癌细胞在流动压力下从细胞体中分裂出大囊泡，然后，分裂的囊泡随血流立即漂移。一方面，癌细胞可能会减少其细胞体积，使其脱离小口径微血管。另一方面，癌细胞可能通过这些“分裂的囊泡”向远处的器官传递信号。
随后，他们在麻醉和注射了膜标记的HeLa细胞后，用DAOSLIMIT对小鼠肝脏进行了活体成像。他们发现类似的现象也发生在哺乳动物中。捕获在小血管中的HeLa细胞在小鼠中直接高速地分裂出大的囊泡或碎片，与斑马鱼的囊泡分裂过程高度相似。此外，他们观察到肿瘤细胞在沿着脉管系统迁移的过程中还可能产生收缩纤维并产生粒状体。这些观察结果突出了DAOSLIMIT对于哺乳动物长期、高速成像的重要性。
长期以来，观察体内大规模亚细胞神经活动一直是神经科学领域的追求。 DAOSLIMIT提供了一种在复杂环境中研究高速3D亚细胞钙动力学的方法。作为演示，他们对人3D脑类器官中自发性钙的传播进行了成像。从两个神经元的交汇处诱发的3D钙波通过时间编码的MIP和正交MIP进行可视化。标记的目标区域（ROI）的时间轨迹说明了单个神经元内钙动力学的多样性。
在未来，DAOSLIMIT或许可在揭示如肠道菌群动力学、免疫反应期间的细胞相互作用、肿瘤转移和组织损伤修复以及神经网络中的小胶质细胞功能等复杂生物学过程中可以发挥重要作用。
教授介绍：
戴琼海，自动控制学家，中国工程院院士，清华大学自动化系教授，清华大学生命科学学院兼职教授，清华大学信息科学技术学院院长。戴琼海长期致力于立体视觉和计算摄像理论、关键技术研究与人才培养。其研究领域包括：（1）智能视觉：探索压缩感知与机器学习的机理和模型，并用于视觉感知、立体重建和图像（视频）检索与挖掘，用于智能机器检测，智能无人机，智能医疗，VR/AR，研制智能十亿像素动态光场成像，用于科学观测和城市监控。（2）智能成像：将智能技术与光学成像技术结合，研究多维多尺度高分辨率智能计算成像技术，可为发现大脑感知和运行新现象、揭示神经网络计算机制，探索脑疾病病理和机理，提供观测工具和海量基础数据，建立脑科学与人工智能的桥梁，为人工智能的发展提供新的思路。
参考文献：
Wu J, Lu Z, Jiang D, Guo Y, Qiao H, Zhang Y, Zhu T,Cai Y, Zhang X, Zhanghao K, Xie H, Yan T, Zhang G, Li X, Jiang Z, Lin X, FangL, Zhou B, Xi P, Fan J, Yu L, Dai Q. Iterative tomography with digital adaptiveoptics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics atmillisecond scale. Cell. 2021 May 21:S0092-8674(21)00532-8. doi:10.1016/j.cell.2021.04.029.