科研 | Cell子刊：肠道共生菌代谢产物介导对沙门氏菌感染的定植抗性
本文由李德利编译，董小橙、江舜尧编辑。
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肠道菌群对病原菌具有定植抗性，从而限制病原菌的增殖和传播。这些菌群介导的机制以往是通过观察抗生素治疗或饮食改变后定植抗性的丧失来确定的，这些改变严重破坏了微生物群落。本文通过比较不同品系小鼠菌群组成和不同程度沙门氏菌感染的关系，明确了宿主菌群介导的针对S. Typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）的定植抗性机制。使用具有不同感染动力学和沙门氏菌负荷的近交小鼠品系，证明拟杆菌属菌群通过产生短链脂肪酸丙酸盐介导沙门氏菌的定植抗性。体外实验表明丙酸盐通过破坏胞质内pH稳态直接抑制病原菌生长，增加肠道丙酸盐浓度能保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏菌伤害。此外，给感染小鼠灌胃拟杆菌属菌群显示出定植抗性而灌胃不产丙酸盐的拟杆菌属突变株不产生定植抗性。
论文ID
原名：A Gut Commensal-Produced Metabolite Mediates Colonization Resistance to Salmonella Infection
译名：肠道共生菌代谢产物介导对沙门氏菌感染的定植抗性
期刊：Cell Host & Microbe
IF：17.03
发表时间：2018年8月
通信作者：Denise Monack
通信作者单位：Stanford University
实验设计
结合前期研究，实验选用不同沙门氏菌感染程度的两种品系小鼠（分别为129X1/SvJ (129) mice 和C57BL/6nramp1+/+ (B6N) mice，简称为129和B6N），通过两者的比较，发现129品系的小鼠经感染后在盲肠、结肠和粪便中的沙门氏菌量都显著高于B6N品系的小鼠。说明相同致病力的沙门氏菌，在B6N小鼠中的定植能力弱于129小鼠，即B6N小鼠中的沙门氏菌定植抗性强于129小鼠。为研究这种抗性与菌群的相关性，通过菌群移植的方法，确定这种抗性与菌群有密切相关性。为研究B6N小鼠菌群中的定植抗性机制，用菌群测序的方法，得到了两种品系的小鼠在菌属水平上的差异，确定了关键菌属——拟杆菌属。设计体外实验，确定拟杆菌属对沙门氏菌的抑制活性，用不产丙酸盐的拟杆菌突变株做对照，找到了其活性产物为丙酸盐。且体外研究了丙酸盐对沙门氏菌的抑制机制——通过控制菌胞质中的PH水平，减慢沙门氏菌的增殖速度。体内实验是将活拟杆菌和加热灭活的拟杆菌属通过探针标记灌胃至小鼠体内，活拟杆菌能定植且能抑制沙门氏菌的感染，丙酸盐水平明显升高；灌胃不产丙酸盐的突变株，小鼠被沙门氏菌感染的程度更为严重。
实验内容
1. 肠道菌群控制沙门氏菌在肠道远端的增殖和粪便脱落
129和B6N小鼠被沙门氏菌感染后，在脾、肝、肠系膜淋巴结和小肠中无差别，但在盲肠、结肠和粪便中的沙门氏菌129明显多于B6N。
图1.沙门氏菌远端肠道定植和粪便脱落在近交系小鼠中的差异
将B6N菌群移植到129中，129的正常组织和健康未受影响，但是能明显抑制沙门氏菌的感染，提示B6N中的某些菌群具有介导沙门氏菌定植抗性的能力。
图2 肠道菌群控制沙门氏菌在肠道远端扩张和粪便脱落
2. 拟杆菌属在B6N小鼠中更为丰富
经菌群测序，发现129和B6N小鼠的菌群α多样性无显著性差异，而β多样性存在明显不同，得出结论：控制沙门氏菌定植抗性的可能是B6N中特异的菌属或是B6N中含量最高的菌属。群落组成分析结果显示，三个属（genera Bacteroides and Prevotella, and family Rikenellaceae）含量明显高于129小鼠。
图3 129和B6N小鼠菌群组成分析结果
3. 拟杆菌代谢产物体外直接抑制沙门氏菌的生长
将上述三个属的菌株代谢产物做体外抗沙门氏菌实验，结果表明只有拟杆菌属的产物能直接抑制沙门氏菌的生长，且对其他菌没有影响（图4）。
图4 拟杆菌属代谢产物体外抑制沙门氏菌生长结果
分别测定未感染沙门氏菌的129和B6N小鼠的短链脂肪酸水平（SCFA），结果表明B6N中丙酸盐的水平是129小鼠中的3倍；选用不产丙酸盐的拟杆菌属突变株进行体外抑菌实验，结果显示该突变株没有抑菌活性。为进一步探究丙酸盐的抑菌机制，研究了在有/无丙酸盐干预的情况下，沙门氏菌的增殖速度与达平台期的时间，用显微镜观察了沙门氏菌在LB培养基上的长成情况。用盐酸调节PH和细胞渗透性PH染色法，发现丙酸盐能削弱沙门氏菌的自体缓冲PH能力，延长菌体快速增殖的时间。
图5 丙酸盐体外抑制沙门氏菌生长机制研究
4. 拟杆菌属产物丙酸盐介导沙门氏菌定植抗性体内实验
将活性正常与加热失活的拟杆菌属混合物用探针标记后在沙门氏菌感染前灌胃到小鼠体内，发现活菌能成功定植，且能影响后续沙门氏菌的感染。但检测小鼠体内主要的免疫指标和控制沙门氏菌感染的免疫应答因子，结果表明无明显差异，表明接种拟杆菌属与增强宿主免疫无关。灌胃不产丙酸盐的突变株后，粪便中的沙门氏菌较正常组更多，感染程度更为严重。直接灌胃丙酸盐，能直接减少小鼠体内的沙门氏菌定植数量，而其他的SCFA无明显含量变化，表明拟杆菌属产丙酸盐是介导沙门氏菌定植的直接作用物质。
图6 灌胃拟杆菌属小鼠抗沙门氏菌感染情况
结 论
本文通过比较两种品系小鼠被沙门氏菌感染的情况，结合菌群结构分析，确定了与沙门氏菌定植抗性有关的拟杆菌属；经体内外实验，明确了拟杆菌属代谢产物丙酸盐通过作用于沙门氏菌胞质的PH环境介导定植抗性的作用机制。
评 论
本文的研究结果不仅指明了与沙门氏菌定植抗性有关的拟杆菌属，还将拟杆菌属关键代谢产物的具体作用机制做了研究，这种作用机制与体内免疫应答和沙门氏菌的毒力因子无关，而是通过调节胞内的PH环境介导沙门氏菌的定植抗性，为宿主的个体化群落在病原菌增殖与传播中的作用及机制研究提供参考借鉴