基因敲除细胞株(系)构建，用质粒？慢病毒？还是RNP法

众所周知，CRISPR-Cas9作为一项基因编辑技术，目前已经是生命科学领域家喻户晓的技术了。但虽说这项技术非常火爆，仍有许多同学对基因编辑技术存在理解偏差，比如最常见的，在应用CRISPR-Cas9构建基因敲除（KO）细胞系，到底采用质粒法、病毒法还是有其他更好的方法呢？

说到这个问题，就不得不提当初CRISPR-Cas9技术刚兴起时，所展现的切割效率和敲除成功率极大的吸引了科研界的关注，但是科研人员进行相关实验时经常会遇到：“一学就会，一做就废”的问题。他们发现，完全按照文献的方法进行基因敲除，成功率并没有想象的高，且还存在对细胞转染效率低的问题。因此有一些课题组就尝试通过慢病毒转染的方式进行敲除，提高转染效率的同时，将Cas9蛋白基因整合到基因组中，通过提高增加Cas9蛋白和sgRNA的作用时间来提高细胞敲除效率。

★慢病毒法★

但是，慢病毒感染存在着两个比较关键的问题：

1. 利用慢病毒法转染Cas9会在敲除靶基因的同时引入新的基因，而且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。

2. CRISPR-Cas9编辑过程存在脱靶效应，慢病毒法会持续表达Cas9蛋白，长期存在的Cas9蛋白会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验的严谨性。

图1. 慢病毒感染进行基因敲除

★质粒法★

为了降低这种脱靶效应，采用的策略是减少Cas9蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间，因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas9和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达Cas9蛋白和gRNA，由于质粒整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒载体的逐渐消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即感染效率较低。

★RNP法★

与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas9蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas9蛋白是不带电荷的，而sgRNA是带电荷的，因此只有当Cas9与sgRNA结合后，才能更高效的将两者转染到细胞中。同时，由于Cas9和sgRNA会被降解，Cas9-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低，但相应的切割效率也可能有一定降低。

图2. Cas9蛋白与gRNA形成RNP复合物

从国内外文献报道的情况来看，质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，对于课题组实验室而言，质粒法可能更容易实施，而对于生物技术企业，RNP法则具有更高的实验效率。但这两种不同的方法只是殊途同归，只要能达到敲除效果的就是好方法。