编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
既往针对特定免疫球蛋白（Ig）受体谱的分析方法成本低且耗时长，本研究提出一种可快速、准确地分析免疫球蛋白谱（包含互补决定区3，CDR3）的计算方法ImReP，利用常规RNA测序数据即可实现。基于ImReP和基因型-组织表达（GTEx v6）数据，本研究收集了360万个免疫球蛋白序列，即称为免疫球蛋白全谱（TAIR），广泛涵盖未曾报道过免疫球蛋白谱的组织类型。同时评估免疫相关组织间的相似性和免疫球蛋白克隆型在组织间的流动性。简言之，本研究获得的TAIR是涵括CDR3序列和组织类型的最大集合之一，将成为免疫疾病研究的重要资源。
原名：Profiling immunoglobulin repertoires across multiple human tissues using RNA sequencing
译名：利用RNA测序分析多个人体组织的免疫球蛋白谱
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.6
通讯作者：Serghei Mangul
通讯作者单位：加州大学定量和计算生物学研究所
DOI号：10.1038/s41467-020-16857-7
适应性免疫的一个重要功能是对特定抗原产生保护性记忆反应。B细胞通过免疫球蛋白（Ig）识别其特异性抗原，免疫球蛋白谱多样性是个体免疫系统抵御多种潜在病原的关键。典型的免疫球蛋白谱由一个免疫球蛋白重链（IGH）和两个轻链κ（IGK）和λ（IGL）组成。Igs通过体细胞重组实现多样化，涉及可变区（V）、多样性区（D）和连接区（J）基因片段的随机组合，并在重组连接处插入或删除未经模板化的碱基（图1a），由此产生的DNA序列被翻译成抗原受体蛋白。上述过程使任何特定个体的免疫球蛋白库都能发展出惊人的多样性。此外，B细胞活化后，体细胞高频突变以及重链和轻链的配对进一步促进免疫球蛋白多样化。同型转换导致B细胞功能多样性。迄今已经开发出多种用于重建免疫球蛋白受体的工具。基于RNA-Seq数据的蛋白谱分析通常起始于将读取的数据映射到国际免疫遗传学（IMGT）数据库的种系V、D和J基因，且利用不同的算法（如MiXCR, IMSEQ和IgBlast）进行映射。所有方法都根据CDR3的定义来确定每次读取中CDR3序列的边界。序列分析的最后一步是纠正已组合的PCR克隆和测序错误。为此MiXCR和IMSEQ对组合的克隆进行聚类，并为每簇报告一个一致的序列。IgBlast跳过纠错步骤，直接输出推断的CDR3序列。大多数方法使用比对或组合推断CDR3s，并将读取的数据与V和J基因比对。相比之下，ImReP程序提供J基因前缀和V基因后缀的读取前缀和读取后缀之间的匹配，而不需要校准。为此，ImReP能够显著地减少运行时间并简化所需的计算资源。将ImReP应用于8555个样本的0.6万亿RNA-Seq读数（92Tbp），以组合成Ig受体的CDR3序列库，RNA-Seq数据由基因型组织表达项目（GTEx v6）产生。首先研究者利用短读数比对器（GTEx执行）将RNASeq读数映射到人类参考基因组中（图1），然后鉴别跨越免疫球蛋白受体V（D）J连接区和组合的克隆型（一组CDR3氨基酸序列相同的克隆）的读数。将CDR3定义为一串始于连接点左侧的半胱氨酸，并止于连接点右侧的苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸序列。此时，ImReP可利用0.02万亿个高质量读数（图1a）。ImReP是一种组合CDR3序列并检测相应V（D）J重组的两步无校准方法（图1b）。第一步从已/未映射的RNA-Seq读数中准备候选受体读数，然后将Ig基因座的部分映射和未映射读数合并到一组候选受体读数中，这些作为ImReP的输入。扫描读数中的氨基酸序列，并确定一个公认的CDR3作为数据库读数的一个子串，起始于半胱氨酸（C）并止于苯丙氨酸（F）（IGK和IGL），但IGH止于色氨酸（W）。每个读数分为三个部分：前缀、CDR3和后缀。用公认的CDR3进一步检查读数，评估V和J基因的重叠情况。Ig受体可变基因从IMGT（版本3.1.17）导入，研究者利用读数起始部位的C（半胱氨酸）和V基因的C为基点，以此与读数前缀和V基因匹配。类似地，利用读数结尾的F（或W）和J基因的F（或W）为基点来匹配后缀和J基因。第二步，ImReP利用包含部分CDR3序列和单个基因片段（V或J）重叠区的读数，然后用免比对的程序分别确定V或J基因与读取前缀或后缀之间的匹配情况。ImReP使用后缀树技术进行匹配，具有至少15个核苷酸重叠的匹配读数才用于组合成全长CDR3。研究者进一步纠正了组合的CDR3中PCR和测序错误，ImReP集群使用CAST算法将CDR3组成一簇，反复重复集群过程直到每个集群内的平均反向编辑距离小于用户定义的阈值。每簇一致的序列报告作为正确的CDR3序列。本文方法部分提供了使用ImReP实现方法的详细描述。ImReP可在https://github.com/Mangul-Lab-USC/imrep免费获取。目前，ImReP支持人类和小鼠Ig受体谱分析。
2.利用RNA-Seq进行免疫球蛋白谱研究的可行性为了验证其可行性，研究者假定RNA-Seq数据为转录组读数和免疫球蛋白转录产物读数的混合。Ig转录本基于V、D和J基因片段的随机重组（从IMGT数据库获得），在重组连接处插入非模板片段。通过将ImReP应用于上述混合数据来评估ImReP从RNA-Seq混合物中提取CDR3相关读数的能力。ImReP能够从RNA-Seq混合物中识别出99%的CDR3源代码，这表明它是一个分析免疫相关组织RNA-Seq样本的有效工具。接下来，研究者将ImReP与其他用于组合Ig受体的方法进行比较，同时研究从RNA-Seq数据中组合Ig序列所需的测序深度和读取长度。结果表明，读取长度和测序深度对CDR3序列组合的精确召回率有重大影响。ImReP在大多数情况下的准确率保持80%，高于八的平均CDR3覆盖率允许ImReP对超过75个bp读取长度的归档召回率接近90%（图2a）。覆盖率的增加对经ImReP获得的组合克隆型的数量有积极的影响。此外，研究者将ImReP与MiXCR，IgBlast和IMSEQ进行比较，ImReP在查全率和查准率方面一直优于现有方法。为了进一步证明应用非特异性RNA-Seq技术分析Ig受体谱的可行性，研究者利用BCR-Seq和RNA-Seq测序的18个肿瘤活检标本，首先将这些读数映射到人类基因组和转录组上，然后提取未映射的读数，并提供给ImReP用于组合IGH克隆型。BCR-Seq数据由系统生成(https://www.adaptivebiotech.com/)并经其配套的分析包进行分析。将BCR-Seq作为评估RNA-Seq方法效率的金标准的一个困难是BCR-Seq捕获DNA克隆型，而RNA-Seq只捕获表达的克隆型。为了解释可能的差异，研究者首先将RNA-Seq读数匹配到主要克隆型上（BCR-Seq检测到的相对频率至少为90%），在18个BCR-Seq样本中，有5个样本没有得到匹配，因而将其排除在外。研究者认为剩余样本中，由BCR-Seq获得的CDR3s集是全部的IGH谱。进一步研究RNA-Seq能够捕获整体免疫谱的哪一部分。基于RNA-Seq，ImReP平均能够捕获53.3%的IGH谱，估计为检测到的经BCR-Seq证实的克隆型总和；而MiXCR能够捕获40.1%。在所有情况下，ImRep都能检测到经BCR-seq证实的克隆型，其相对频率超过90%。相比之下，MiXCR只在83.3%的病例中检测到这些克隆型。当主要克隆型的频率下降到10%以下时，ImReP在60%的病例中能够检测到主要的克隆型，而MiXCR只在20%的病例中检测到一个克隆型。研究者还比较了每种方法检测到经BCRseq证实的小克隆型的能力。所有样本中微小克隆型的平均频率为0.37%。ImReP能够在38%的样本中检测到轻微的克隆型（图2e）。这两种方法都能够准确地估计组合克隆型的相对频率（图2c，d）。用于处理数据和运行本研究中使用的所有工具的脚本和命令可在https://github.com/Mangul-Lab-USC/ImReP_publication获取。此外，还研究了基于部分CDR3重叠（实际上并非来自同一读数）的V和J基因融合读数的可能性。研究者获得了3129个基于BCR-Seq的IGH转录本（来自一个健康的初始B细胞测序谱），以此为参考模拟高达16倍覆盖率的BCR-Seq的IGH转录本。在ImReP的第二步，50bp读数的灵敏度提高了16%以及75bp读数的灵敏度提高了4%，而100 bp读数未观察到任何改善。在75bp情况下，精确度的降低会导致F分数的整体下降。基于上述模拟读数，研究者建议对50bp的读取应利用ImRep的第二步（在ImReP中以默认设置实现）。更进一步，研究者验证了ImReP精确推断样本组织中免疫细胞比例的能力。假设样本中B细胞的比例与RNA-Seq数据中受体读数的比例成正比，使用基于转录组的计算方法SaVant，该方法使用细胞特异性基因特征（独立于Ig转录本）来推断每个组织样本中B细胞的相对丰度。SaVant使用的B细胞信号源于CD19+细胞，代表了最大数量的B细胞亚群，并且许多CD19阴性的B细胞亚群可能携带与CD19相似的基因特征。结果发现经SaVant得到的B细胞特征与IGH谱的大小呈正相关（图2f）。这些含有高密度B细胞的组织（脾脏、全血、小肠（回肠末端）、肺和EB病毒（EBV）转化的淋巴细胞（LCLs））是例外。
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