CRISPR/Cas9原理及应用

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 RNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合，是继ZFN、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因点突变大、小鼠动物的第四种方法，可快速、准确对大小鼠及其他物种进行遗传改造。

随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用，除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。

在基因组编辑的世界里，CRISPR/Cas9代表着王牌。它为研究人员带来了一种简单的方法，将核酸酶、转录调控因子或荧光蛋白送到基因组中的任何地址。这种方法已改变了疾病研究、基因调控、药物开发等，因此也成为了一大研究热点。

CRISPR/Cas9 gene targeting 原理示意图

为了实现利用简单的方法使特定基因失去功能，科学家研发出了RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，希望更易于研究哺乳动物细胞的基因功能，它具有操作简单、效果明显等优点。但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元)，而且存在位置效应、临时性和不完全敲除的缺点。

就目前来说，CRISPR/Cas9 技术的效率已经非常高，基本可以在经过一次打靶过程就可以得到基因敲除的小鼠，而传统的基于同源重组的技术则需要更长的时间。基于CRISPR/Cas9基因敲除技术其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因；作为一种新型的靶向基因编辑技术，CRISPR/Cas9 技术已成功在斑马鱼、小鼠和大鼠等多个物种中得到了广泛应用，此外该项技术不存在动物物种的限制，其在植物基因修饰中也取得了突破，如大豆、烟草、水稻和小麦中都取得了成功。

CRISPR 技术的优势是能永久性地改变基因组DNA的序列，但在基因沉默方面RNAi 技术也有其独特的优势。具体来说首先RNAi无需引入额外的蛋白质因子，更安全，成本更低；其次RNAi 是一种转录后水平的可逆的基因沉默技术，只需通过siRNA的添加与否，或使用小分子化合物调控siRNA表达载体上诱导型启动子的活性就能实现对靶基因的沉默与开启；最后RNAi在转录后水平调节基因的表达，故设计siRNA时只需参考转录组数据。

RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元)，而且存在位置效应、临时性和不完全敲除的缺点。

CRISPR 技术的优势是能永久性地改变基因组DNA的序列，并且可以在不编码的DNA区域进行编辑，可以多个位置同时进行编辑。

对于广大科研朋友来说，使用Crispr/cas9技术也能够为发表论文和申报基金课题加分。