老奥说 | 漫谈培养基开发史（一）

前言

细胞培养基开发半个多世纪，一代代科学家卓绝努力实现了一个个看似不可能的技术突破，期间江湖上也有许多轶事。时间轴上看培养基开发可以分三个阶段：1.1957-1997（从血清到无血清）；2.1998-2011（从无血清到化学成分确定）；3.2011-当下（国内生物医药崛起）。

老奥说

学史以明智，鉴往而知来。

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缘起

小小细胞蕴藏着无限能量，1957年科罗拉多大学医学系教授Dr. Theodore T. Puck从中国仓鼠中分离出卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO），并成功进行体外连续传代培养。60多年后，超过80%的上市及临床阶段重组蛋白和抗体药物通过CHO细胞表达，这些药物年销售超过千亿美金，Puck博士当时或不曾料到CHO细胞会有如此广阔的应用和深远的贡献。

正如花草树木需要土壤，细胞没有培养基提供营养和环境就不能生长。虽然动物细胞体外维持培养的研究可以追溯到20世纪初甚至更早，但培养基配方开发划时代的里程碑当属Harry Eagle博士分别于1955年和1959年在《科学》杂志上发表的两篇研究文章：1955年Eagle博士发布细胞基础培养基配方，并指出培养基是“一个包含无机盐、氨基酸、糖、维生素及其它必须营养物的等渗透压且具有pH缓冲能力的混合物”。Eagle在1959年的文章中提出了进一步改进的配方，并将该配方命名为“Minimal Essential Medium (MEM)”。MEM配方需要在10%以上的牛血清浓度下才能支持细胞生长，但即使在60年后的今天MEM培养基仍然被用于研究领域和一些疫苗生产工艺里，Eagle的研究工作无疑奠定了近代无血清培养基开发的基础。

02

优化

血清含有上千种不同成分，为细胞体外培养提供广泛而丰富的营养和各种细胞因子，早期的培养基公司创业都是从提供牛或者马的血清开始的。但动物血清的使用存在引进外源病毒的风险，因此减少血清浓度甚至完全去除血清对细胞培养有着重大的意义。

1960年代无血清培养基开发可以分为两个研究方向推进：

一条路线是寻找能替代血清支持细胞在体外扩增的营养成分。血清含有上千种不同成分，为细胞体外培养提供广泛而丰富的营养和各种细胞因子，但动物血清的使用存在引进外源病毒的风险，因此减少血清浓度甚至完全去除血清对细胞培养有着重大的意义。

另一条路线则更加重视优化配方中营养物成分和浓度实现细胞的高密度培养，需要指出血清的添加未必能提高细胞密度，科学家通过研究培养基中营养成分的消耗，发现提高氨基酸和维生素的浓度可以提高细胞最高密度。

上述两条路径又是有交叉的，沿着两条路径科学家们在60-80年代间研发出许多不同系列的培养基配方。

         代表性配方 

1. Dulbecco和Freeman于1959年发表了改进版的MEM配方Dulbecco’s MEM （DMEM）；

2. 1984年Iscove又在DMEM基础上进一步改进推出了IMEM配方；

3. Moore等人1967年推出RPMI（Roswell Park Medical Institute）系列配方，RPMI在维持无机盐浓度的前提下提高了氨基酸维生素等成分的浓度；

4. 1965年和1984年Richard Ham博士发布了F-10和F-12系列培养基；

5. Charity Waymouth博士1984年研发了MCDB系列配方。

         老牌企业 

在此，必须提到1960’s年代成立的几个老牌培养基：GIBCO、HyClone和JRH：

1. GIBCO（Grand Island Biological Company），1962年由Bob和Earline Ferguson 夫妇在纽约州格兰德岛自家车库创立细胞培养公司，早期生产用于细胞培养的血清。1983年GIBCO与BRL（Bethesda Research Laboratories）公司合并，公司启用新名字Life Technologies，这是LIFE最早的由来。

2. HyClone，1967年在犹他州洛根市成立，早年是基于犹他大学研究高质量胎牛血清开始，Logan距离盐湖城开车有一个小时多点的路程。

3. JRH Biosciences，1967年在澳大利亚成立，早期提供血清产品。澳洲也一直是优良血清的产地。

除了上面三家，另外几个小品牌如LONZA、BD、Irvine和其它一些小培养基公司，诞生的时间比较晚。

到了1980年代，Gordon Sato博士和同期其他科学家进一步优化配方，并在替代血清方面取得突破：通过在基础培养基里添加蛋白（如胰岛素、转铁蛋白和白蛋白），可以在很大程度上替代血清。而后1982年Hiroki Murakami博士发现了另外一个在无血清条件下促进细胞倍增的主要成分乙醇胺，由此提出了ITES混合物作为无血清培养基的添加剂（Insulin、Transferrin、Ethanolamine和Selenium），ITES添加可以降低或者免除血清添加并实现高密度细胞培养。

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突破

历史性的突破在90年代，1991年GIBCO推出CHO-S-SFM系列无血清培养基实现了CHO细胞完全无血清培养。白蛋白的主要功能是作为微量元素的载体，进一步研究发现微量元素等可以替代白蛋白的添加；类胰岛素生长因子IGF-1可以替代胰岛素；改进铁离子往细胞内转运可以替代转铁蛋白。90年代中期出现了最早的无蛋白培养基（Protein-free Medium，PFM），PFM 往往还含有蛋白水解物，而通过用植物来源的水解物代替动物蛋白胨进一步降低了动物来源成分的风险。

1997年GIBCO推出的CD CHO是第一个完全化学成分确定的培养基（Chemically-defined Medium，CDM），在那个水解物广泛采用的时代，CD CHO是个培养基开发历史上的里程碑，培养基开发从此进入一个全新的时代。

与此同时，GIBCO的命运也发生了重大转折。那个时候，Life Technologies在纽约证交所历史最久的上市公司Dexter Corporation的下面，Dexter是家族企业，可以溯源到美国独立战争前，最早是从事锯木厂业务的。1999-2000年上市刚刚一年的加州公司Invitrogen以$19亿美金现金加股票的方式收购了Life Technologies，LIFE也因此消失于行业视野直到2009年。

后记

在GIBCO推出CD CHO的那年夏天，老奥用在研究院两年挣来的几百块工资买了套西装，回到魔都梅陇路上的大学，终于读上了心仪的生物化工专业研究生。导师张元兴教授给了个研究课题：“CHO细胞无血清培养基开发生产促红细胞生成素（rhEPO）”，从此与培养基结缘至今。

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