@大黄鱼、生鱼、加州鲈养户，快收藏这个防控大招，不再惧怕顽疾——诺卡氏菌
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华中农业大学 陈昌福、武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军、浙江省舟山市海洋与渔业局 陆珍珠 李金蓉 油九菊 夏枫峰
摘要：采用日本化学疗法学会制定的标准法，检测了鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）对金霉素（chlortetracycline）耐药性形成与消失速率。结果证明，将N.seriolae在金霉素浓度递增的培养基中连续转接4次后，金霉素对N.seriolae的MIC由最初的0.39µg/L上升到了6.25µg/L。将已经对金霉素获得了一定耐药性的N.seriolae，在未添加药物的培养基中，连续转接5次，金霉素对N.seriolae的MIC由最初的6.25µg/L下降到了3.13µg/L。
关键词：鰤诺卡氏菌；金霉素；耐药性；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度
在我们前面的试验研究结果中，已经证明金霉素（chlortetracycline）对于危害淡水养殖鱼类的部分常见致病菌具有比较好的抑、杀菌效果。认为金霉素有望被开发为一种水产用抗生素类兽药，在水产养殖动物细菌性疾病治疗中发挥其作用。
金霉素被作为治疗养殖畜、禽类动物细菌性疾病的兽药，在畜禽疾病治疗的临床上已经应用较长时间了[1]。人们在应用金霉素治疗养殖畜、禽细菌性疾病的过程中发现，将这种抗生素作为控制养殖动物传染性疾病的兽药，对养殖畜、禽等动物细菌性疾病具有比较好的药物治疗效果[2]。但是，关于水产养殖动物致病菌对金霉素耐药性的形成与消失速率，则尚未见有比较详细的研究报道。
本研究利用能引起大黄鱼（Larimichthys crocea）、乌鳢（Channa argus）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）等养殖鱼类诺卡氏菌病（nocardiosis）的鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae），检测了其对金霉素的耐药性产生和消失速率，旨在为科学制定将金霉素作为水产用兽药的科学用药程序提供基础数据。现将试验结果报告如下。
1
材料与方法
1.1供试药物及药液制备
本次采用的供试药物为市场是购买的含量为92.0%的金霉素原料药。采用蒸馏水将金霉素制备成10000.0µg/L浓度并作为供试原药液，作为下面试验中的药物原液，冷藏备用。
1.2致病菌的培养及其菌液制备
将引起海、淡水鱼类链球菌病的N.seriolae，接种在脑心浸液琼脂（BHIA，Difco）培养基中，置于28℃的恒温培养箱中培养72h后，采用灭菌生理盐水分别洗下菌落，配置成107cfu/mL菌液浓度，备用。
1.3最小抑菌浓度（MIC）测定
参照日本化学疗法学会制定的标准法进行[4]。在无菌条件下，取定量的药液，在盛有灭菌脑心浸液（BHI，Difco）培养基试管中，做2倍系列的稀释。制作成药物浓度分别为100.0µg/L、50.0µg/L、25.0µg/L、12.5µg/L、6.25µg/L、3.13µg/L、1.56µg/L、0.78µg/L、0.39µg/L、0.20µg/L和0.10µg/L的药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL的活菌液加入上述每支试管中，摇匀。置于28℃条件下培养78 h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.4最小杀菌浓度（MBC）测定
在无菌条件下，从每个未出现抑菌效果的试管中，取0.1mL的培养基，接种在盛有2.7mL经过高压灭菌后BHIA培养基的玻璃试管中，轻摇动使菌液分布均匀后，将接种后的试管置于在28℃恒温培养箱中继续培养72h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。
1.5耐药性获得速率测定
在无菌条件下，从出现抑菌效果最高药物浓度的试管中，分别吸取0.1mL的培养基，接种在较该试管药物浓度相同和更高的含有药物的系列培养基试管中，摇动均匀后置于在28℃恒温培养箱中培养72h后，经肉眼观察试管内有无细菌生长。继续从出现抑菌效果最高药物浓度的试管中，分别吸取0.1mL的培养基，进行如此重复地操作，连续5次后，比较药物对N.seriolae的MIC浓度的变化，根据下一次转接时测定的MIC/上一次培养后检测的MIC计算其比值，作为耐药性形成速率。
1.6耐药性消失速率测定
在无菌条件下，从出现抑菌效果最高药物浓度的试管中，分别吸取0.1mL的培养基，接种在未添加药物的经过高压灭菌的培养基试管中，摇动均匀后置于在28℃恒温培养箱中培养72h后，经肉眼观察从有细菌生长的试管中，继续吸取0.1mL的培养基，进行如此重复地操作，连续5次后，检测N.seriolae对金霉素的MIC浓度的变化，根据上一次转接时测定的MIC/下一次培养后检测的MIC计算其比值，作为耐药性消失速率。
2
结果
2.1 N.seriolae对金霉素耐药性获得速率
将N.seriolae初次在添加有不同浓度金霉素培养基中，经过在28℃培养箱中培养72h后，观察MIC结果如图1所示，从图1所示结果可见，金霉素对N.seriolae的MIC为0.39µg/L。
图1，金霉素对鰤诺卡氏菌（N.seriolae）的最小抑菌浓度（MIC）
经过在药物浓度不断递增的培养基中连续传接4次的培养，金霉素对N.seriolae的MIC检测结果见表1。从表1所示结果可以看出，最初检测金霉素对N.seriolae的MIC为0.39µg/L，
表1,鰤诺卡氏菌（N.seriolae）对金霉素耐药性获得速率
|
接种 次数 |
最小抑菌浓度 （MIC，µg/L） |
最小杀菌浓度 （MBC，µg/L） |
耐药性 获得速率 |
|
1 |
0.39 |
6.25 |
|
|
2 |
1.56 |
12.5 |
4 |
|
3 |
3.13 |
25.0 |
2 |
|
4 |
6.25 |
25.0 |
2 |
|
5 |
6.25 |
50.0 |
1 |
经过1次转接后，金霉素对N.seriolae的MIC上升到1.56µg/L，即计算的耐药性获得速率为4。而经过第2次和第3次转接后，N.seriolae对金霉素的耐药性获得速率均为2，第4次转接后，计算到的药性获得速率为1，即N.seriolae对金霉素的耐药性没有再继续上升。
由图2所示，经过4次转接，金霉素对N.seriolae的MBC由最初的6.25µg/L上升到了50.0µg/L。
图2，金霉素对鰤诺卡氏菌（N.seriolae）的最小抑菌浓度（MIC）
2.2 N.seriolae对金霉素耐药性消失速率
将经过4次在药物浓度不断递增的培养基转接培养，N.seriolae已经对金霉素获得了比较高水平耐药性，将其获得了耐药性的菌株连续转接在未添加金霉素的培养基中，共经过4次转接培养后，金霉素对N.seriolae的MIC检测结果见表2。从表2所示结果可以看出，最初检测金霉素对N.seriolae的MIC为6.25µg/L，经过1次转接后，金霉素对N.seriolae的MIC没有变化，即耐药性消失速率为1。而第2次转接后，金霉素对N.seriolae的MIC为3.13µg/L，其耐药性获得速率均为2，第3和第4次次转接后，计算到的药性获得速率为1，即耐药性没有再继续消失。
表2,鰤诺卡氏菌（N.seriolae）对金霉素耐药性消失速率
|
接种 次数 |
最小抑菌浓度 （MIC，µg/L） |
最小杀菌浓度 （MBC，µg/L） |
耐药性 获得速率 |
|
1 |
6.25 |
50.0 |
|
|
2 |
6.25 |
50.0 |
1 |
|
3 |
3.13 |
50.0 |
2 |
|
4 |
3.13 |
25.0 |
1 |
|
5 |
3.13 |
25.0 |
1 |
3
讨论
致病菌对抗生素耐药性获得或者消失速率的快与慢，在一定程度上决定这这种抗生素类药物的使用程序等[5]。
迄今为止，虽然我国有几种抗生素类药物被批准作为水产用兽药，治疗养殖动物的细菌性疾病。但是，由于当时申报企业在申请生产许可证的相关技术资料中，没有完成较为详细的试验研究，导致这些水产用兽药被水产养殖者使用的各个环节，均存在一些实际问题。如兽药生产企业在申请生产某种抗菌素药类渔药时，所提供的申请技术资料大多只有药物对某些水产动物致病菌的抑、杀菌效果的相关实验结果，而没有提供药物的在对水产养殖动物使用的过程中，致病菌对药物耐药性产生变化的相关实验结果。又如由于我国的水产执业兽医制度处于刚刚起步阶段，疾病的诊断与药物的使用几乎全部是由水产养殖业者自己完成的。他们在选择某种水产用兽药作为水产养殖动物疾病治疗药物时，因为没有针对致病菌的药物敏感性实验结果作为选择药物和使用剂量的依据，就只能根据兽药生产企业提供的使用说明书选择和决定各种水产用兽药的使用剂量。结果必然是导致在不明白致病菌对药物敏感性的情况下，盲目地决定使用什么药物和剂量。
众所周知，致病菌对抗菌素类药物的耐药性是在随着接触该药物次数而不断地变化的，当其接触某种抗菌素的次数越多，对这种抗菌素产生耐药性就越强。楠田等（1988）在五条鰤（Seriola quinqueradiata）养殖现场分离大量的杀鱼巴斯德菌（Pasteurella piscicida）菌株进行药物敏感性测定结果表明，该菌对多种抗生素产生的耐药性程度是不相同的。
为了避免水产养殖动物致病菌对抗生素类药物产生耐药性，水生动物执业兽医在指导水产养殖业者选择抗菌素类药物，作为治疗水产动物细菌性疾病的治疗药物时，应该从患病动物体内分离致病菌并测定致病菌对拟选药物的敏感性，只有在获得各种抗菌素类药物对致病菌的MIC的基础上，水产用兽药的使用者才有可能作到正确选择药物和决定药物的准确用量。否则，就有可能因为不知道致病菌对不同种类抗菌素耐药性的变化背景，而造成实际上的盲目用药。
需要在这里这种说明的是，我国的水产养殖动物中已经出现了诸如由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、鰤诺卡氏菌（N.seriolae）等革兰氏阳性菌引起的疾病，但是，抗革兰氏阳性菌效果比较好的抗生素类水产用兽药，则比较缺乏。现在，对于由革兰氏阳性致病菌引起水产养殖动物的疾病，水产养殖业者也只能才有抗革兰氏阴性菌效果比较好的药物应付，这种应对措施当然是会影响治疗效果的。
4
参考文献
[1]孙刚，袁守军，彭书传，陈凤琴，胡真虎.固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素[J].环境化学，2010，4，36~40.
[2]赵淑英，王洪涛，朱莉萍，孙军，鲁新春.高效液相色谱法测定畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的研究[J].食品科技，2008，3，5~8.
[3]安树伟，袁思平，王国良.患诺卡氏菌病的大黄鱼几种主要组织的酶活力变化分析[J].渔业科技进展，2012,33（2）：43~47.
[4]日本化学疗法学会.最小发育阻止浓度の测定方法[J].化学疗法，1975，23（8）：1~2.
[5]楠田理一，板冈睦，川合研儿.1984年および1985年に养殖ブリから分离されたPasteurella piscicidaの药剂感受性[J].日本水产学会志，1988，54（9）：1521~1526.
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