基因敲除技术实验原理及流程

基因敲除实验原理：

CRISPR-Cas9基因敲除系统是Cas9内切酶切割双链DNA，生物体启动NHEJ修复途径，切割位点产生移码突变，导致基因沉默。

NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制，用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。主要用于当DNA发生断裂时，NHEJ修复途径被开启，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因（图3）。因此，在沉默编码基因时， gRNA应靶向基因的N端来确保最大程度的基因破坏。

基因敲除实验流程：

1.设计sgRNA

2.构建sgRNA-Cas9载体

3.构建sgRNA-Cas9稳转株

4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证

5 .阳性克隆测序，选择敲除純合细胞株

6 .筛选细胞单克隆测序

基因敲除实验步骤：

➤ 1、设计sgRNA

针对小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。 进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

➤ 2、构建sgRNA-Cas9载体

然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（图1）。

图1 sgRNA-Cas9载体图谱

➤ 3、构建sgRNA-Cas9稳转株

利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

➤ 4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证

嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。 提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑.

图2 qPCR检测基因组编辑情况。在野生型（WT）测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带（总和WT的长度）表示编辑已经发生。图2表明，克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

➤5 、阳性克隆测序，选择突变细胞株

通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质（图3）。

图3 细胞基因组测序结果。对于细胞集落3，只检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除。 在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

➤ 6 、筛选细胞选择单克隆純合突变细胞株

将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择。 从这些克隆（即6a，6b ..）中提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

图4细胞基因组测序结果。测序显示，在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变（图4）。 移码突变破坏了开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA。

➤ 7.进一步测序，确定純合突变

图5 细胞基因组测序结果