【综述】胸椎黄韧带骨化相关分子信号通路的研究进展
文章来源： 中华骨科杂志,2020,40 (10): 680-688
作者：张保良 陈仲强
胸椎黄韧带骨化症（thoracic ossification of ligament flavum, TOLF）是一种脊柱韧带异位骨化性疾病，是导致胸椎管狭窄的最常见原因，占所有病因的72.3%[1,2,3]。TOLF发病隐匿，临床表现复杂多样，多出现慢性进行性胸脊髓病变，表现为病变节段以下的双下肢感觉和运动功能异常，严重者可伴有大小便障碍等[4,5]。
对于合并明显临床症状者，手术减压是目前惟一有效的治疗方式[6]。TOLF所致胸脊髓病变的致残率高，手术难度较大、风险高、术后并发症较常见，且TOLF常合并胸椎间盘突出、后纵韧带骨化以及颈椎病、腰椎管狭窄等病变，同时骨化部位呈多节段分布，责任病变的定位诊断较困难[7,8,9]。因此，对TOLF进行精准的临床诊疗是一项巨大的挑战。然而，探究TOLF的病因和发病机制，对早期预防和治疗黄韧带骨化具有重大意义。
近些年，国内外学者对于TOLF的基础研究多从基因组学、转录组学和蛋白质组学等领域阐述其发生的分子生物学机制，而信号通路在TOLF的发生和发展过程中起到了重要的作用。目前，与TOLF有关的信号通路有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路和STAT3信号通路等。本文通过对TOLF相关分子信号通路进行综述，旨在探讨TOLF发生和发展的分子机制，对进一步探索有效的治疗靶点和预防方式提供理论参考和研究方向。
本文以'黄韧带骨化'、'信号通路'、'发病机制'、'ossification of the ligament flavum'、'ossification of the yellow ligament'、'OLF'、'OYL''signaling pathway'、'pathogenesis'等为关键词，在CNKI、万方、Pubmed、Cochrane library、Web of science等数据库进行检索，重点筛选与黄韧带骨化相关信号通路有关的文献。
纳入标准：①黄韧带骨化发病机制的文献；②黄韧带骨化相关信号通路的文献；③符合知情同意和临床伦理要求的文献；④发表时间在2020年之前的相关文献。排除标准：①无法获取全文的文献；②中、英文以外的文献；③质量较低、证据等级不高的文献；④重复研究。共检索得到795篇文献，删除不符合要求的文献744篇，最终纳入51篇（图1）。
图1 文献筛选流程图
一、BMP信号通路
BMP是骨基质中广泛存在的一种酸性蛋白，属于转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族成员，根据序列相似性和功能可分为4个亚族：①BMP-2和BMP-4；②BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a和BMP-8b；③BMP-9和BMP-10；④BMP-3、BMP-3b、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15和BMP-16，其中BMP-2、BMP-7、BMP-6、BMP-9能够促进骨细胞分化、增生及骨损伤修复[10,11]。BMP受体包括7种Ⅰ型受体（ALK 1-7）和5种Ⅱ型受体（ActRⅡA、ActRⅡB、BMPRⅡ、TβRⅡ和AMHRⅡ）[12]。研究表明，BMP参与了软骨内成骨过程，其中BMP-2与Ⅰ型和Ⅱ型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体蛋白形成的异四聚体复合物结合，经BMP激活后，可使细胞内信号分子Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，而后联合Smad4转移到细胞核，与转录因子Runx2发生作用，上调成骨细胞基因的表达，从而促进成纤维细胞转化为成骨细胞，诱导骨化形成（图2）[12,13]。
图2 BMP/TGF-β信号通路示意图。BMP或TGF-β结合并激活其Ⅰ型或Ⅱ型受体，并导致相应的Smads磷酸化；活化的Smads与Smad4形成复合物，移位到细胞核，启动并激活成骨细胞特异性转录因子（如Runx2、Sox9、Osterix等），从而诱导间质干细胞向成骨细胞分化及骨形成
黄韧带骨化的病理本质是软骨内成骨，多项研究已证实BMP-2及相关信号通路参与了骨化的发生和发展。Moon等[14]将腺病毒介导的BMP-2基因转染黄韧带细胞，在应力作用下，黄韧带细胞中胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的基因表达水平增加，TGF-β1水平也有明显提升，证实经刺激的黄韧带可通过自分泌和旁分泌BMP的方式诱导周围正常黄韧带细胞向成骨细胞分化。Kim等[15]研究发现Runx2或BMP-2在原代培养的黄韧带细胞中的高水平表达促进了细胞的成骨分化，而BMP-2和Runx2联合处理较任一成分单独处理能获得更好的成骨细胞分化。此结果表明，虽然Runx2作为BMP信号通路的一部分，但Runx2和BMP-2通路同时拥有共同和独立的靶基因，两者联合介导了黄韧带骨化的形成。研究证实，BMP/Smad1信号通路调节成骨细胞生命周期的特定方面，包括从间质干细胞向成骨细胞的分化、成骨细胞增殖、成骨细胞矿化的活力和破骨细胞偶联[16]。Shunzhi等[17]研究了机械应力对黄韧带细胞成骨分化的作用机制，他采用蛋白免疫印迹法分析测定BMP蛋白和Smad1蛋白表达，发现未拉伸组和对照组之间未观察到显著差异，而拉伸组OLF细胞中BMP蛋白和Smad1蛋白表达显著增加；并且骨钙素（osteocalcin，OCN）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等成骨相关因子的表达上调，说明机械应力通过BMP/Smad1信号通路影响人类黄韧带细胞的成骨分化。
二、MAPK信号通路
MAPK是一组广泛存在于细胞中的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，能被多种细胞外信号刺激发生磷酸化而激活[18]。MAPK信号通路由MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MAPKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MAPKK）和MAPK三种连续作用的蛋白激酶组成，每个下游激酶作为上游激活剂的底物发挥作用，即活化的MAPKKK磷酸化并激活下游的MAPKK，随后MAPKK磷酸化再激活MAPK，以级联方式将细胞外信号放大并传入细胞核内，然后调节转录因子调控下游靶基因的表达，从而调节细胞增殖、分化、凋亡等[19,20]。MAPK家族包括多个亚家族，其中细胞外信号调节激酶（ERK）、p38激酶（p38）和c-Jun末端激酶（JNK）在细胞的成骨分化过程中发挥了重要的作用（图3）[21]。
图3 MAPK信号通路示意图。MAPK信号通路被细胞外信号刺激发生磷酸化而激活，首先MAPKK激酶（Raf、MLK3、TAK1、MEKK1/4等）被激活并磷酸化MAPK激酶（MEK1/2、MEK3/6、MEK4/7），而后磷酸化激活相应的MAPKs[细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、p38激酶（p38）、c-Jun末端激酶（JNK）]，活化的ERK、p38、JNK进入细胞核激活Runx2、Sox9、Osterix等成骨转录因子，调节成骨细胞分化及骨形成
已有大量研究表明，多种细胞外因素通过MAPK信号转导通路影响黄韧带骨化的进程。Fan等[22]研究发现，在牵拉应力作用下，胸椎黄韧带细胞中的ERK1/2和p38通路被激活，而JNK通路未受影响。此外，p38特异性抑制剂SB203580显著抑制牵拉刺激诱导的Osterix表达和ALP活化，而ERK1/2特异性抑制剂U0126仅轻微减弱了ALP活性，但完全抑制了Runx2表达，提示不同的MAPK信号通路在黄韧带细胞成骨分化中的不同活化状态。Zhong等[23]也证明了重组人生长分化因子5（growth differentiation factor 5, GDF-5）促进黄韧带细胞的成骨分化是通过特异性地诱导ERK1/2和p38的磷酸化来实现，而不是JNK通路。李学斌等[24]首次提出骨桥蛋白（osteopontin，OPN）参与了黄韧带骨化的发病过程，且证明MAPK信号通路在骨桥蛋白介导黄韧带骨化中的重要作用，p38是诱导黄韧带细胞成骨分化的关键因子。Zhang等[25]通过实验证明了促炎性细胞因子——肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α）通过丝裂原活化蛋白激酶ERK途径激活Osterix表达，促进黄韧带细胞的成骨分化。另外，卢昌怀等[26]研究证明p38 MAPK信号通路通过介导TGF-β1/结缔组织生长因子对人腰椎黄韧带增生肥厚起重要的调控作用。许国峰等[27]研究了骨桥蛋白和自噬在黄韧带骨化发生中的作用机制，发现经骨桥蛋白诱导后，ERK、JNK和p38通路均磷酸化而激活，其中ERK、JNK磷酸化明显，p38相对较弱。这与之前研究结果有一定差异，可能与样本量或不同干预方式有关。总之，以上研究均表明MAPK信号通路在黄韧带骨化发生、发展中起了一定的作用。
三、Wnt信号通路
Wnt是一类富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，其构成的Wnt信号通路被看作是调控细胞在整个生命周期中增殖、分化、衰老等活动的重要分子级联反应之一[28]。Wnt信号通路包括依赖于β-catenin功能的经典信号通路（Wnt/β-catenin通路）和独立于β-catenin运行的非经典通路（Wnt/Ca2+通路和平面细胞极性通路）[28]。目前发现的Wnt配体至少有19个，大多数信号通过经典的Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，其中β-catenin是该信号通路的中心靶点和必需成分[29]。在正常稳态下，β-catenin作为降解复合物的一部分而稳定存在，当分泌的Wnt通过与跨膜受体Frizzled和辅助受体LRP 4、5或6结合，诱导LRP胞质尾部磷酸化，抑制GSK-3β活性，使β-catenin磷酸化并以单体形式从其降解复合物中释放出来，在细胞质中逐渐积累，最终移位至细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，促使靶基因激活，从而调节细胞的生命活动（图4）[30,31]。
图4 Wnt/β-catenin信号通路示意图。当细胞外有Wnt蛋白时，与跨膜受体Frizzled和辅助受体LRP 4、5或6结合而磷酸化，抑制GSK-3β活性，促使β-catenin自降解复合体释放，在细胞内大量聚集并进入细胞核内，继而启动下游靶基因的表达，促进成骨细胞分化及骨形成
Wnt信号通路作为调节骨代谢和骨形成的重要通路之一，在黄韧带骨化的发生机制中扮演着重要的角色。Cai等[32]研究发现，来源于黄韧带骨化患者的黄韧带细胞与对照组样本相比，β-catenin、Runx2、Sox9和骨桥蛋白表达水平更高；并且将周期性拉伸应力作用于培养的细胞24 h，则进一步上调了黄韧带骨化细胞中β-catenin、Runx2、Sox9和骨桥蛋白的表达水平，而对照组细胞中蛋白表达几乎未受影响。机械应力下转录因子和β-catenin信号的mRNA表达水平较高，表明β-catenin信号的瞬时激活是黄韧带骨化发生、发展中的重要过程。Yayama等[33]对骨化的黄韧带组织进行免疫组化分析，发现Wnt共受体LRP 6和LRP 5在骨化前沿周围的间质细胞和软骨细胞中高水平表达，而在对照组样本中，未观察到Wnt共受体免疫反应；黄韧带组织骨化区附近的间质细胞中观察到Wnt 3a免疫反应性。此外，在骨化黄韧带组织中的间质细胞，尤其骨化前沿的未成熟软骨细胞中，β-catenin免疫组化染色呈阳性，对照组呈阴性。这说明Wnt信号在OLF骨化成熟过程中具有关键作用。
四、Notch信号通路
Notch蛋白是广泛存在于细胞表面介导细胞信号转导的受体蛋白。Notch信号通路主要包括Notch受体、Notch配体和靶基因，4种受体为Notch 1~4，5种Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)配体，分别为Jagged (Jag) 1和2及Delta-like (Dll) 1、3和4，均为单通道跨膜蛋白[34]。Notch胞内结构域（NICD）与DSL配体结合后被裂解释放，转位至细胞核，与EB病毒潜伏C启动子结合因子1（CBF1）/hairless抑制因子/Lag1（CSL）等转入因子形成蛋白复合物，共同启动靶基因的表达[35]。Notch信号通路越来越被认为是人类骨骼发育和骨代谢平衡过程的重要参与者。Notch通路能够调控细胞的成软骨分化和成骨分化，Notch通路的失调可能导致骨硬化、骨质疏松、软骨发育不良、骨关节炎、骨肉瘤等一系列骨骼疾病（图5）[36,37]。
图5 Notch信号通路示意图。当Notch受体与Notch配体结合后，信号通路被激活，Notch受体在TACE及γ-分泌酶的作用下水解释放出NICD片段，并转移至细胞核内与CSL蛋白，激活并启动其下游靶基因及成骨转录因子（Runx2、Osterix等）的表达，调控成骨分化及骨形成
近年来有学者发现Notch信号通路也参与了黄韧带骨化的病理过程。Qu等[38]测定了在成骨培养基中培养的黄韧带骨化患者和对照组患者的黄韧带细胞中Notch信号的时空表达差异，发现与对照组相比，OLF细胞中JAG1/Notch2/HES1表达在第7天增加，并在第14天维持，且早期成骨指标ALP和晚期指标OCN、OPN也显著上调，第7天可见矿化结节的形成，第14天明显升高。另外，当使用shRNA慢病毒载体敲除Notch 2时，黄韧带细胞的成骨分化受到抑制，而pN2ICD载体使Notch 2过表达时，黄韧带细胞的成骨分化能力增强。这些结果支持Notch信号通路在人黄韧带细胞成骨分化中的作用。Qu等[39]在此基础上进一步研究发现miR-199b-5p可以通过靶向结合JAG1，并通过抑制Notch信号来抑制黄韧带细胞的成骨分化。由此推测JAG1和miR-199b-5p可能是黄韧带骨化，甚至其他骨化性疾病的治疗靶点。Yang等[40]阐明了Notch信号通路在血管生成和黄韧带骨化过程中的作用，刺激血管生成素2（angiopoietin 2, ANGPT2）的表达增强了Notch2的表达和成骨分化，而抑制ANGPT2则表现出相反的作用；此外，下调Notch 2表达不能影响ANGPT2的表达。这一系列结果表明Notch信号通路是ANGPT2调节黄韧带细胞成骨分化的机制之一，尽管不能排除其他可能机制。
五、STAT3信号通路
JAK-STAT信号转导通路与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节和炎症反应密切相关[41]。JAK是一类蛋白酪氨酸激酶，共包括4个成员：JAK1、2、3和Tyk2，STAT是JAK的底物，共包含7个成员：STAT1~4、STAT5a、STAT5b、STAT6[41]。该信号通路可被许多细胞因子和生长因子激活。细胞外信号作用于相应的受体后，与受体偶合的JAK激酶发生磷酸化并被活化，并使酪氨酸残基处的STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白以二聚体形式移位至细胞核内，与靶基因结合并诱导其转录与翻译[42]。STAT3广泛存在于不同类型的细胞和组织中，且多项研究证明STAT3信号通路调控多种细胞的成骨分化（图6）[42,43,44]。
图6 Stat3信号通路示意图。细胞外信号作用于相应的受体后，与受体偶合的JAK激酶发生磷酸化并被活化，并使酪氨酸残基处的STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白以二聚体形式移位至细胞核内，与靶基因结合并启动相应成骨转录因子的表达，从而调控成骨分化及骨形成
目前，关于STAT3信号通路在黄韧带骨化发生机制的研究较少。Fan等[45]在研究瘦素刺激OLF患者黄韧带细胞成骨分化的分子机制时，发现给予一定时间瘦素处理的OLF细胞与对照组相比，磷酸化的STAT3表达水平随时间的延长而逐渐升高，而STAT3的总表达水平并无变化；然后用选择性抑制剂AG490阻断STAT3磷酸化可显著减少瘦素诱导的OLF细胞成骨分化。此外，进一步实验发现STAT3与Runt相关转录因子2（Runx2）在细胞核中相互作用，STAT3、Runx2和类固醇受体共激活因子-1（SRC-1）是Runx2靶基因启动子募集的转录复合体的组成部分，在瘦素刺激OLF细胞成骨分化的过程中起重要作用。类似地，Sugimoto等[46]在研究腰椎黄韧带肥厚的发生机制中也发现了STAT3信号通路的参与；他对黄韧带肥厚组织的成纤维细胞进行体外实验，结果显示，IL-6通过诱导STAT3信号的磷酸化增加了基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达、分泌和活化，刺激弹性蛋白降解进而导致黄韧带的纤维化，并且使用STAT3抑制剂处理可终止该作用过程。这些结果证明STAT3信号通路在炎性因素致黄韧带退变中的具有调控作用，为研究黄韧带骨化提供了一个新方向。
六、其他相关信号通路
Wang等[47]探索了表观遗传学与黄韧带骨化相关性，发现AKT信号通路调控了黄韧带细胞成骨分化的过程。首先实验证明了m6A去甲基化酶ALKBH5在黄韧带骨化细胞中表达，进一步发现ALKBH5的过表达使AKT磷酸化，激活了AKT信号通路，使成骨基因表达增加，促进了黄韧带的骨化；而当ALKBH5被敲除时，与对照组相比，AKT的磷酸化被抑制，成骨分化能力明显减弱。另外，当单独过表达ALKBH5时，矿化和ALP活性可通过BMP-2的去甲基化进行调节。然而，ALKBH5的这种作用依赖于BMP-2的表达水平和AKT信号通路的激活，抑制BMP-2和AKT的活性时，ALKBH5的作用明显受限。因此，研究揭示了ALKBH5通过激活AKT信号通路使BMP-2去甲基化，从而促进黄韧韧骨化的机制。Jun和Kim[48]为了探索FGF2基因、FGFR基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与脊柱韧带骨化之间的相关性，对157例脊柱韧带患者的血液样本进行直接测序并进行分析，发现所有相关的9个SNP中，FGF2基因中的RSl47621与OLF有显著的相关性，可以推测FGF信号通路可能调控TOLF的发生、发展，但尚需进一步的研究证实。此外，研究发现MiR-132-3p[49]、MiR-615-3p[50]、MiR-490-3p[51]等多种因子可与叉头转录因子（forkhead box O1，FOXO1）靶向结合来抑制黄韧带细胞成骨分化，这也提示FOXO1及其相关通路可能是胸椎黄韧带骨化可行的治疗靶点。
综上所述，TOLF作为一个多基因参与、多因素作用、涉及多步骤的复杂生物过程，目前已证实多条分子信号通路在这一过程中起重要的调控作用，其中多个信号分子直接或间接影响Runx2、Osx、OPN、ALP等成骨相关因子的表达，从而调控黄韧带细胞的成骨分化（图7）。然而，现阶段研究尚存在一定的局限性。参与TOLF的多条信号通路之间必然存在着相互联系和相互作用，形成一个复杂的分子调控网络，但目前的研究以单一通路为主，无法彻底揭示TOLF具体的发病机制。因此，未来的研究既要继续探索更多的与TOLF发病相关的信号通路，多角度地理解黄韧带细胞成骨分化的分子机制，又要更深入研究各通路的精确机制及通路与通路之间的关联机制，从而寻找关键靶点，为早期预防和治疗TOLF提供依据。
图7 各信号通路参与调控黄韧带骨化的病理过程。不同的外界刺激或病理改变，包括机械应力、炎症刺激（TNF-α、IL-6）、内分泌及代谢异常（瘦素）、血管因素（angiotensin-2）、细胞分子（microRNA、OPN、GDF-5等）及表观遗传等，可直接或间接激活相应的细胞信号通路（BMP信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Stat3信号通路及AKT信号通路等），促进特异性成骨转录因子Sox9、Runx2、Osterix等转录增加，从而调节骨髓间质干细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化和增殖，最终引起OLF形成和进
参考文献（略）