皮下荷瘤实验详解

肿瘤细胞系移植模型(CDTX)因易构建、成瘤率高、周期短等优点而广泛应用,并且目前临床上常用的抗肿瘤药大多是通过该模型而被发现。本期咱们就首先为大家介绍,CDTX模型中看似最简单却深藏多种不确定因素的皮下荷瘤。

皮下荷瘤定义

肿瘤细胞系移植到同种或异种动物的皮下形成肿瘤块,荷瘤是将肿瘤细胞移植到小鼠体内的专业说法,皮下荷瘤属于肿瘤细胞系移植模型(CDTX),CDTX还包括各种转移模型荷瘤、原位荷瘤等。

皮下荷瘤应用

一般用于抑制肿瘤生长(细胞增殖)的药物的筛选检测。如果单独研究肿瘤在小鼠体内的生长,那么几乎所有的肿瘤均可通过皮下荷瘤进行实验研究。

第一部分:皮下荷瘤模型的几个考虑因素

(1)肿瘤细胞系的选择

肿瘤细胞株的选择,是一个很麻烦的问题,却是最重要的问题。有以下几点要求:

① 不同肿瘤细胞系的成瘤率不同,需选取成瘤率高的细胞系;如乳腺癌细胞MCF-7,虽在体外应用多,但体内成瘤率差,生长慢,因此一般不选用;

② 肿瘤细胞根据分子标记分为多种,考虑成瘤率外,选择时还需考虑实验目的,如针对药物靶点HER2,需要选择HER2高表达的肿瘤细胞如SKBR-3,而不是HER2阴性的MDA-MB-231;再如研究靶向kras突变肿瘤的药物,我们选取kras突变的(其突变类型又属于突变率比较高的),又易培养且成瘤率好的A549。

③ 实验用肿瘤细胞株多为人源或鼠源细胞系,根据实验目的选择,一般鼠源细胞系更易荷瘤,但是人源细胞系会更贴近人类肿瘤生长情况。

(2)小鼠品系的选择

由于肿瘤细胞系主要分为人源和鼠源,因此小鼠品系的选择要根据细胞系来源。

人源细胞系:为异种移植,应该选择免疫缺陷的小鼠(如:nude,NOD/scid,NSG,详情点

击链接3.2 免疫缺陷动物(一)。

鼠源细胞系:为同种移植,选择与肿瘤细胞系来源一致的小鼠(C57BL/6品系来源的黑色素

瘤细胞系B16F10就要选择C57BL/6品系的小鼠)。不过裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系统

异常,不适用于筛选免疫调控药物。

(3)接种部位  

应选择血管丰富且易操作的部位,如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位。其中腋下中部皮下较好,成瘤率高。如下图所示:

Nude裸鼠腋下处皮下荷瘤(人源乳腺癌细胞系SKBR-3)

Balb/c小鼠腹股沟皮下荷瘤(鼠源结肠癌CT26)

第二部分:裸鼠皮下荷瘤步骤

一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系,然而由于存在免疫排斥,需选择裸鼠荷瘤。

下面以裸鼠为例,为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程

 肿瘤细胞的传代扩增

取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增,确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态

 计算细胞接种量

根据经验,一般鼠源肿瘤细胞接种2~100万/只,而人源肿瘤细胞则需要200-1000万/只以

上。当然最好结合文献来确定细胞接种量,在找不到相关资料的情况下,最高就用到1000

万/0.1ml,不可再高(因为细胞悬液已达饱和状态)。并且提前计算确定细胞数量,一般注射40只小鼠,至少需要准备50只小鼠的细胞量。

 准备裸鼠

一般选择5-6W裸鼠,小于4W动物可能不耐受而过早死亡,大于6W免疫力会增强,不

易成瘤;

每批实验只用同一性别动物,通常雌雄均可,但是根据研究的肿瘤类型及肿瘤细胞系选择(乳

腺癌等要选择雌性,前列腺癌等要选择雄性)

⑷ 操作步骤(请观看视频)

① 接种时选择好部位进针,建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置;

② 向前方穿行,注射前针头稍微动一动,能动说明在皮下,否则可能在皮内或者肌肉内;

③ 针头在皮下走一段再注射,速度不可太快,一般体积为100-200μL(PBS或者无血清培养基稀释细胞,若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤),可看见明显的鼓包;

④ 接种点离进针点尽量较远,减少漏液和污染的可能;

⑤ 注射完毕后,缓慢退出针头,尽量避免漏液;

⑥ 细胞需一直置于冰上,使细胞处于比较低的代谢状态,一般2h之内不会有问题。

下面为皮下荷瘤视频(包括各个部位的注射手法):

视频

第三部分:后续实验安排

⑴ 分组:一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测,因此我们一般分为对照组,阳性药物组,低剂量、中剂量及高剂量药物组等;

⑵ 数量:荷瘤时每组不少于10只,考虑到小鼠成瘤率和死亡原因,最终实验应至少可以获取6个有效数据;

⑶ 给药时间:一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起,便可分组实验(鼠源细胞系会更快);

⑷ 人道终点:动物伦理学规定,小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%,平均肿瘤直径

不超过20mm,并且如果出现溃烂,造成感染或坏死时,应该中止实验且对动物施行安乐死。

补充正常免疫小鼠的荷瘤

基本步骤与裸鼠荷瘤一致,只是比较繁琐的是,由于野生型小鼠有毛发,所以需要剃毛(如

上图Balb/c小白鼠腹股沟皮下荷瘤鼠源结肠癌CT26)

第四部分: 皮下荷瘤的几点问答

⑴ 瘤子长不出来是怎么回事?

一方面可能是细胞状态差,活力不好,或是肿瘤细胞不易成瘤,需加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系;一方面可能是小鼠周龄太大,或小鼠免疫排斥,建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠(Nod-scid小鼠,NOG小鼠> Nude裸鼠)

⑵ 小鼠瘤子长起来又消失?

肿瘤块先缩小,后变大很常见,很可能是炎症反应,肿瘤细胞被小鼠自身吸收,继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来,长不起来建议换鼠。

⑶ 均一性很差,肿瘤体积差距较大?

如果荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大,这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致,建议重新做实验分组。

⑷ 是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤?

不可以,一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下,可能会相互影响。

⑸ 是否应用免疫抑制剂加速肿瘤生长?

如果裸鼠荷瘤不生长,可以参考文献,用免疫抑制剂如环磷酰胺(抑制裸鼠NK细胞活性)

促进生长;不过最好不要为了缩短造模周期来加速生长,因为可能会造成溃烂,这样就不得

不中止实验。所以一般情况下,应尽量符合细胞系本身的生长特性,不应过多地人为的干扰。

皮下荷瘤实验介绍就到此结束了,原来看似简单的实验却有多种不可忽视的因素需要考虑。

简单回顾一下,皮下荷瘤模型中细胞系和小鼠品系是最需要考虑的两大因素,切记一定要多

查阅文献并结合预实验,进而找到最合适的皮下肿瘤模型。

(0)

相关推荐

  • 皮下荷瘤实验的介绍及应用(二)

    第二部分:裸鼠皮下荷瘤步骤 一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系,然而由于存在免疫排斥,需选择裸鼠荷瘤. 下面以裸鼠为例,为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程 ⑴ 肿瘤细胞的传代扩增 取冻存于液氮的肿瘤细胞 ...

  • 【专题】电功率公式及实验详解,收藏!

    电能 电功 定义:电流所做的功叫电功.电功的符号是W 单位:焦耳(焦,J).电功的常用单位是度,即千瓦时(kW·h).1kW·h=3.6×106J 电流做功的过程,实际上就是电能转化为其他形式能的过程 ...

  • 高中化学人教版《必修1一课本实验详解》

    高中化学人教版《必修1一课本实验详解》

  • 初中物理电功率专题公式及实验详解

    学完了电路电流.电压电阻,接下来就是电功率了,这也是电学中比较难的一部分,相关公式和导出式也比较多,所以一定要自己推导一下,真正理解记忆,做题的时候才能比较快. 电能 1 电功 定义:电流所做的功叫电 ...

  • 裸鼠皮下移植瘤实验造模步骤

    顾名思义,这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下.种植的点也有讲究,一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝.可根据实验设计选择移植点,统一移植点的位置,除了遵守实验统一的条件外,待肿 ...

  • 布丰投针实验详解

    1777年,法国数学家布丰(D,Buffon,1707年-1788年)提出了随机投针法并通过投针实验计算出了圆周率π的值,与刘徽的"割圆术"不同的是,随机投针法是利用概率统计的方法 ...

  • 讲堂精粹 | Annexin V凋亡检测实验详解

    细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed cell death),是一种为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的主动的死亡.凋亡的紊乱与肿瘤.自身免疫性疾病的发生具 ...

  • 电功率专题公式及实验详解,想拿高分的看过来!

    学完了电路电流.电压电阻,接下来就是电功率了,这也是电学中比较难的一部分,相关公式和导出式也比较多,所以一定要自己推导一下,真正理解记忆,做题的时候才能比较快. 电能 1电功 定义:电流所做的功叫电功 ...

  • 重难点电功率公式及实验详解

    电能 电功 定义:电流所做的功叫电功.电功的符号是W 单位:焦耳(焦,J).电功的常用单位是度,即千瓦时(kW·h).1kW·h=3.6×106J 电流做功的过程,实际上就是电能转化为其他形式能的过程 ...