抗体药物Fc功能优化的概念化设计及应用
摘要
抗体及抗体样Fc融合蛋白已近成功用于癌症治疗，过继性免疫治疗感染，成瘾，以及自身免疫性疾病。通常这些生物药用于阻断蛋白质之间的相互作用，涉及宿主受体与诱导信号的作用，重新招募效应细胞到靶细胞周围，以及固定补体系统蛋白等等。由于抗体在感染和遗传性疾病治疗方面巨大的潜能，众多的研究致力于提高抗体效能和特异性功能方面。而抗原抗体之间的相互作用也显得尤为重要，其重要性不亚于抗体铰链区及重链恒定区在抗体发挥功能中的作用。抗体铰链区和恒定区通过结合宿主受体或补体蛋白介导效应功能及调节抗体的循环。分子水平及结构分析研究已经揭示了不同种属，不同亚类抗体铰链区和恒定区如何识别宿主受体及补体蛋白的作用机制。分子层面的详细解读使得人们可以通过干预铰链区及恒定区序列，糖基化修饰达到增强或降低抗体效应功能和改变抗体半衰期的目的。本文着重描述概念层面上对抗体铰链区，Fc区优化，并描述相应的优化介导的抗体生物学效应以及潜在的临床疾病治疗应用价值。
背景
自1986年第一款单克隆抗体药物经FDA获准上市，抗体及抗体衍生物药物快速增长，截止2015年有44款抗体药物在美国和欧洲获准上市。与预期一致的是抗体药保持着每年新增6-9种的速度，目前已攀升多达70多种。预计在接下来的几年内全球基于抗体的治疗药物销售额将达到600-750亿美元。因此，很多制药企业涉足抗体样分子并以此作为他们收入及当地税收的增长点。
基础科学持续致力于基因紊乱，癌症，感染性疾病的发病机制研究，发病机制的深入研究助力基于抗体的生物药抵消这些非正常生物进程中的作用，起到临床治疗的效果。抗体如何抵消这些非正常生物学进程可以通过优化选择那些经过序列修饰的抗体分子进一步增强或者废除它们与宿主免疫系统的作用来达到。企业及科研实验室关于抗体修饰的概念论证是走向应用的基础。很多获准上市的抗体包括传统意义上经典的单克隆抗体以及经过优化的抗体像Orencia R (abatacept),Soliris (eculizumab), Nplate (romiplostim), 和Removab 都是已证实有效的优化抗体治疗药物。
为了优化抗体功能，从业者需要对抗体的构造，以及组成元件的作用深入了解。一个完整的抗体分子包含两条50KDa的重链和两条25KDa的轻链，组成150KDa的可溶性的免疫球蛋白。每条重链和轻链之间通过二硫键以及非共价键形成稳定的异二聚体，两个异二聚体之间通过重链之间的二硫键形成完整的抗体。每条重链和轻链形成的异二聚体包含抗原结合片段Fab,铰链区，Fc组成。铰链区又分为上，下，和核心区，Fc片段包含重链恒定区的CH2和CH3结构域。
抗体的恒定区也有助于抗体重链序列的变化。抗体重链可变区结合抗体重链恒定区构成完整的抗体重链。依据重链恒定区α，μ，γ，ε，δ的不同，结合可变区抗体分为不同的类型。在人类中，依据γ基因片段的不同又分为IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 4个亚类，而它们的相似程度高达90%。临床上，每个亚类专职清除着不同病原体。例如，IgG2缺陷与荚膜病菌感染有关。其分子机制可能是个体缺乏IgG2类抗体对致病菌多糖的清除减弱。抗体Fc的工程化，对不同类型，不同亚型的抗体优化非常重要，其原因在于序列的变化决定了抗体与受体FcRn,FcαR,FcγR,以及补体蛋白C1q的亲和力和特异性。其中FcγRs中有5类通过结合IgG来激活效应细胞,这些激活受体型包括FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡc,FcγRⅢa,FcγR,Ⅲb5类激活性受体,和1类抑制型FcγR——FcγRⅡb。FcγRs具有多态性，某些等位基因对于Fc有高度亲和力，例如FcγRⅢa中V158与F158相比对IgG1 Fc有更高的亲和力。抗体结合与这些受体可以有效募集效应细胞靶向靶细胞或者病原体并对其清除（图1A）。因此，对于Fc以及铰链区序列突变和翻译后修饰的改变赋予抗体及其抗体样蛋白在效应功能及体内循环半衰期上的改变。除了序列突变，Fc区含有一个297位N-连接的糖基化位点，这对抗体结构和功能都很重要。大多数已获准的临床抗体药为IgG,其亚型多数为IgG1,目前有3款IgG2类型的抗体药在美国上市，IgG3含有较长的铰链区容易被蛋白酶切割，以及相对于其它亚型较短的半衰期。由于这些原因IgG3类抗体还未作为治疗型抗体的亚型。由于绝大多数临床获准抗体药物为IgG类，优化IgG与FcγR的结合主要集中在Fc的工程化优化上。然而，其他类型抗体如IgA,IgM,IgE类抗体由于也具有跟Fc受体的相互作用，所以值得关注，文章后面会介绍到在Fc工程化中的应用。
本文主介绍对于Fc与其作用蛋白之间相互作用的优化或者减弱的一些方法的应用。文章集中介绍Fc序列改变，糖基化改变，从而达到改变Fc引起的效应功能，Fc的优化主要集中在单点突变引起的加强或者消除Fc与受体的结合，或者二者兼有，通过本文的学习，获取一些关于Fc选择及改造的相关知识。
图1.基于抗体的药物应用
抗体Fc突变引起的效应功能增强
增强FcγR的结合
与FcγR的结合，是抗体行驶其效应功能所必需的，例如抗体依赖的细胞毒性（ADCC）,抗体依赖的细胞吞噬（ADCP），以下描述的是Fc优化影响与FcγR结合引起的ADCC与ADCP的增强。
点突变增强与FcγR的结合
已经有多种方法尝试优化抗体的Fc来增加它与相应的FcγR的结合（表1和图2）。Shields et al 等人通过丙氨酸扫描确定Fc暴露氨基酸残留的相应位点，其指导原则为IgG1 Fc结构改变不超过3.2Å。Fc丙氨酸突变的筛选主要依靠与FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡb,FcγRⅢa和FcRn的结合，这些点突变可以划分为增强或者减弱与FcγR和FcRn结合两类。27个独特突变显著增加了FcγR和FcRn中1类受体的增强结合。为了试图工程化Fc达到与介导ADCC效应的FcγRⅢa的强结合，丙氨酸扫描突变结合了不止一个突变位点。一个组合突变Ser298Ala, Glu333Ala,和 Lys334Ala ，也称作AAA突变，可以显著增强IgG1与FcγRⅢa的结合（表1），与FcγRⅢa结合的增强使得拥有AAA突变的Herceptin 在体外杀伤Her2+细胞的杀伤效果提升了50-100倍。
在一个直接的评估方法中，Lazar et al等人用计算机辅助测算氨基酸替代对于Fc与FcγRⅢa相互作用的提高。他们也得出了一系列高质量的突变显著提高抗体的稳定性和可溶性，与野生型Fc相比，Ser239Asp 和Ile332Glu 单点突变可以将Fc与FcγRⅢa的结合提高1个数量级（如图2A），为了Fc与FcγRⅢa的结合最大化，将Ser239Asp 和Ile332Glu 两个单点突变结合，双点突变将Fc与FcγRⅢa的结合提高2个数量级（如图2A）。然而，Ser239Asp 和Ile332Glu 双突变也增加了与抑制性受体FcγRⅡb的结合。这一不太令人满意的负面效应可以通过增加Ala330Leu 突变形成Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu 突变部分的抵消掉。Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu通常称作DLE突变已经被引入抗癌药物Trastuzumab 的Fc中。与野生型Trastuzumab相比，引入DLE突变的抗体药引起的ADCC效应杀伤HER2+的癌细胞，无论在低表达还是高表达HER2+癌细胞,其杀伤效果都提高了2个数量级。DLE突变也增强了整合素抗体体药物MEDI-522 ADCC作用,针对黑色素瘤的杀伤效果显著提高。类似的，该突变还增强了针对CD20抗体药物Rituximab的ADCP抗肿瘤作用。
表1.Fc修饰增强抗体效应功能
在细胞水平上，DLE突变抗体相对于野生型抗体可以招募更多的NK细胞到抗体包裹的靶细胞周围。接近90%的招募NK细胞参与到除此相互作用的靶细胞杀伤中，随后移动到其他可以相互作用的靶细胞周围参与杀伤。因此，随着时间的推移，单个NK细胞可以杀伤众多的相互作用靶细胞杀。这种DLE优化的抗体逐渐增加招募NK细胞有效杀伤靶细胞的作用机制归因于增加了FcγRⅢ介导的信号，主要体现在ZAP70的磷酸化，以及引起的下游信号转导。
包含Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu (DLE突变)的Fc晶体结构解释了突变引起的Fc对FcγRⅢa结合的影响。结构显示突变的Fc在构象上呈开放状态，与野生型Fc相比，突变的Fc两个CH2结构域之间的距离增加了30 Å。热稳定性测定显示打开状态的CH2结构域使得CH2结构域稳定性降低，DLE突变使CH2结构更加灵活。优化的Fc与FcγRⅢa相互作用模型用来筛选评价DLE突变能否增加Fc与FcγRⅢa相互作用。的确，从结构上显示，Ser239Asp/Ile332Glu突变增加了Fc与FcγRⅢa上Lys158形成额外的氢键，Ala330Leu突变增加了Fc与FcγRⅢa上Ile85的氢键。另外，结构模型也显示二者之间的静电作用以及疏水作用力都有所增加。
Mimoto et al.等人设计了非对称的Fc优化结构结合DLE突变形成了新的Fc优化结构，在大量的突变筛选中，他们加测了1000多个Fc单点突变,结果显示那些增加了与FcγRⅢa结合的突变，仅仅需要突变IgG重链就可以实现。他们从整合进重链恒定区突变库中选择出了3个点突变Leu234Tyr, Gly236Trp, 和 Ser298Ala（称作YWA突变）。鉴于DLE已经被证实显著增加Fc与FcγRⅢa的结合，他们将筛选到的突变整合进另一条抗体重链的恒定区。因此，抗体一条重链的恒定区包含YWA突变，另一条重链恒定区整合进了DLE突变。体外ADCC实验显示这样非对称组合显著强于对称的YWA突变和DLE突变结构。因此，这样的Fc非对称结构设计使得人们可以将多个优化突变整合进两条重链以增强Fc功能。
巨噬细胞通过FcγRⅡa参与抗体介导的吞噬作用。为了增加抗体与FcγRⅡa的相互作用Richards et al.筛选了900多个Fc突变体与FcγRⅡa相互作用，鉴定发现Gly236Ala突变使得Fc与FcγRⅡa结合增加了近6倍，无论等位基因131位是His,还是Arg。不幸的是，Gly236Ala在增加了Fc与FcγRⅡa相互作用的同时，却降低了IgG1与激活型受体FcγRⅠ的结合。为了恢复与FcγRⅠ的相互作用，先前的Ser239Asp/Ile332Glu突变被引进入IgG1 Fc,这个组合型的3点突变使Fc与FcγRⅠ结合增加了近3倍，与FcγRⅡa相互作用增加了70倍，与FcγRⅢa的相互作用也增加了31倍。Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala突变体外实验显示增加了FcγRⅡa依赖的吞噬作用以及FcγRⅢa依赖的ADCC作用，这些作用都有助于IgG1型抗体药物杀伤恶性腺癌细胞。
激活性受体FcγRⅡa与抑制性受体FcγRⅡb相似度高达90%，因此，在Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三点突变引起Fc与FcγRⅠ和FcγRⅢa相互作用增加的同时，也使得Fc与FcγRⅡb相互作用也提高了13倍。为了比较突变导致的Fc与激活型受体的结合和Fc与抑制性受体的结合谁将占据主导地位，结果显示，无论是Gly236Ala单点突变，还是Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三点突变与激活性受体FcγRⅡa的相互作用都显著强于与抑制性受体FcγRⅡb相互作用。因此，占据主导地位的Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三点突变最终决定了抗体的功能。Smith et a等人试图进一步提升Fc与FcγRⅡa的相互作用，于是结合了一系列突变产生了Gly236Ala/Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu突变，称作GASDALIE突变。这个集合突变是本来野生型Fc与等位基因158位为F的FcγRⅢa弱结合提升了30倍，这很可能是由于Fc突变体与FcγRⅢa静电引力增加的缘故。类似的，该组合型突变相应增加了Fc与FcγRⅡa的相互作用近25倍，但是与FcγRⅡb亲和力的增加并不明显，这使得突变的Fc与FcγRⅡa的结合以及Fc与FcγRⅡb结合的比例从野生型Fc与二者结合比例的1.6倍提升到11.6倍。在第二类实验中，科学家专注于优化Fc使其突变体避免增加与FcγRⅡb的结合。借助于酵母展示系统，科学家筛选鉴定那些增加与FcγRⅢa相互作用，减少与FcγRⅡb相互作用的突变。通过酵母展示系统，将这些突变体展示于酵母表面，首先将与FcγRⅡb beads相互作用的Fc淘汰掉，将淘选的文库再去与FcγRⅢa beads结合，通过两级不同的文库淘选，最终筛选到7个点突变个体缺乏与FcγRⅡb的结合，却增加了与FcγRⅢa结合的Fc突变。这些突变随后被逐个或者组合引入IgG1的Fc中。组合Phe243Leu, Arg292Pro, Tyr300Leu, Val305Ile, 和Pro396Leu的突变Fc显示与FcγRⅡa, FcγRⅢa解离速率相对于野生型Fc显著降低，同时也没有增加与FcγRⅡb受体的结合，包含5个突变的Fc被称作18突变体，该突变与FcγRⅡa, FcγRⅢa的相互作用增加了10倍，与FcγRⅡb相互作用提高了不到2倍。体外试验显示，18突变使7种抗体药对结肠癌，卵巢癌，乳腺癌有很强的ADCC杀伤效应。在动物模型上Phe243Leu, Arg292Pro, Tyr300Leu, Val305Ile, 和Pro396Leu的突变的IgG1抗体药显著增加了卵巢转移癌小鼠模型的存活率。这些突变已经在人类癌症治疗中得到了证实，包含18突变的HER2单克隆抗体药相对于trastuzumab ADCC作用有了显著提高。在一项临床试验中在接受Margetuximab治疗，78%响应患者中肿瘤体积相对缩小，显示该优化突变具有潜在的改善疗效的作用。
图2.提高抗体Fc介导功能的策略
糖基化工程改善抗体与FcγR结合
IgG1 的Fc在297位上含有1个N连接的糖基化位点。N297位上的寡糖通常有两种N-乙酰葡萄糖胺构成，三种甘露糖，多与两个的乙酰葡萄糖胺连接着甘露糖形成双叉寡糖复合体。两个乙酰葡聚糖胺通过β1,2与甘露糖通过α-3 或 α-6 相连。因此，每个臂上的寡糖依据GlcNAc2上甘露糖连接方式不同区分为α1,3或α1,6寡糖。另外，岩藻糖，半乳糖，唾液酸，N乙酰葡萄糖胺都可以添加在寡糖核心结构上（如图2B）。人类血液中循环的IgG通常为岩藻糖化的，然而，重组抗体在植物中表达，基因工程方法敲入，敲出特异性的糖基化酶，或者在体外通过酶消化都可以改变重组抗体的糖基化形式（如图2B）。因为抗体重链的两条重链都可以糖基化，因此，在单抗体分子中有可能也存在着明显的寡糖异质性。寡糖可以直接影响Fc与FcγR的结合。Fc上Asn297的寡糖与FcγRⅢa由于存在空间位阻，阻碍了Fc与FcγRⅢa的结合，从而导致了抗体介导的ADCC作用降低。核磁共振显示，在FcAsn297含有不同的寡糖时，其铰链区的构象存在着差异。因为抗体的铰链区与FcγR相互作用。所以N297位的糖基化间接影响了Fc与FcγR相互作用。也因此，Fc糖基化的优化对抗体生物学功能优化非常有意义。
为了调节抗体的活性，一些研究专注于抗体的糖基化修饰，通过宿主细胞糖基化酶的表达或者抑制调节重组抗体的糖基化。在表达β(1,4)-Nacetylglucosaminyltransferase III的宿主细胞中表达重组抗体，将产生具有更好ADCC效应含有N297双叉糖基化的重组抗体。Davies et al.等人用此方法产生的CD20抗体增加了与FcγRⅢa相互作用，抗体药对通过依赖FcγRⅢa对CD20+细胞杀伤作用提升了10-20倍。尽管对平分的N乙酰葡糖胺糖基化引起抗体效能的提高存在着争议，这里存在另一种假设，移除岩藻糖有助于提高抗体效能（图2B）。抗体岩藻糖缺陷已经被证实对FcγRⅢa的相互作用提升了50倍，ADCC作用也显著增强。相对于F158的FcγRⅢa，去岩藻糖化抗体Fc与V158的FcγRⅢa有极高的结合力。去岩藻糖基化抗体相对于岩藻糖基化抗体与两种等位基因差异的FcγRⅢa相互作用都有所增强。这种去盐藻糖基化抗体显著增加与糖基化FcγRⅢa的结合，当FcγRⅢa 移除掉Asn162位糖基化位点后，由去岩藻糖基化引起的抗体与FcγRⅢa结合作用的增强被抵消废除。其机制是糖基化FcγRⅢ的结构决定了其识别作用，抗体Asn297位去盐藻糖化的寡糖作用于FcγRⅢa Asn162位的寡糖。Fc寡糖中的岩藻糖与FcγRⅢa 中的GlcNAc2存在空间位阻，这就从结构上解释了去岩藻糖化抗体为什么可以增强与FcγRⅢa的相互作用。mogamulizumab(POTELIGEO R )是第一个在日本获准上市的通过去岩藻糖基化增强ADCC作用的抗体药物。
通过交换不同抗体亚型Fc结构域增加与FcγR的结合（亚型交叉抗体）
除了引入突变和改变糖基化修饰增加抗体与受体的亲和力。Fc可以被优化到与广泛的Fc受体结合（图2C）。如前所述，除了FcγR,还多种Fc受体亚型广泛存在与特异的白细胞表面。为了创造可以结合多种Fc受体(FcγR和FcαRⅠ)的Fc,一种新颖的抗体被开发出来作用于效应细胞。中性粒细胞是机体最丰富的白细胞，他们通过FcαRⅠ与IgA抗体的Fc相互作用。IgA2的一个结构域被添加在IgG1的恒定区构成了新的恒定区结构域(CH1g-CH2g-CH3g-CH3a)，该抗体可以与FcγRs和FcαRⅠ结合。为了使恒定区更接近于IgA恒定区，IgG恒定区的CH1结构域被IgA的CH1结构与替换，形成CH1a-CH2gCH3g-CH3a的恒定区。这种四结构域交叉结合形成的IgGA嵌合抗体结合了类似于IgA2的J链降低了与多聚Ig受体的结合。该四结构域交叉抗体也降低了与FcγR1的亲和力3-5倍，而且抗体的血清半衰期相对于IgG1也有所降低。尽管有诸多缺点，四结构域交叉IgGA嵌合抗体可以介导补体依赖的绵阳红细胞裂解作用和相对于IgG1良好的PH耐受性。类似的，第二种交叉类型Fc抗体创造了出来，该抗体融合了IgG1的CH1和IgA的α恒定区，形成串联的G1-A结构，在设计上IgA2的铰链区，CH2,CH3融合在IgG1的C端。该交叉串联的IgG/IgA设计与IgG1有类似的表达水品，抗原结合力，热稳定性等。在体外，该交叉串联的IgG/IgA与野生型的IgG和IgA对FcαRI and FcγRI, FcγRII, FcγRIIIa,和 FcRn有类似的亲和力。这种与多种FcRs的结合介导多核细胞，NK细胞抗体依赖的ADCC作用。串联交叉的IgG/IgA抗体与C1q的结合相对于IgG1与C1q的结合降低3倍。最近，在BALB/c小鼠实验中，串联交叉的IgG/IgA循环半衰期类似于IgG1。在第3种设计中，Kelton et al设计了一种交叉抗体用α恒定区交换了CH3和CH2结构域及CH1 α1 loop245-258残基(PKPKDTLMISRTPE（图2C）。这种嵌合抗体可以与FcγRI, FcγRIIa, 和FcαRI相结合。IgGA嵌合抗体可以介导多核细胞引起ADCC效应，介导巨噬细胞引起ADCP作用以及激活补体反应。然而，这种设计缺少抗体与FcRn的结合来调节抗体的半衰期。因此，需要进一步优化以提高抗体在体内的效应功能。最后，展示出该设计概念在广泛的效应细胞中具有普遍的适用性。
IgG多聚化以提高与FcγR的结合
多聚化的IgG在自身免疫性疾病治疗方面显示出良好的疗效。IgG多聚化可以通过多种形式实现，像添加异质性多聚化的异亮氨酸拉链结构。另一个铰链区序列添加在天然铰链区的C端或者CH3结构域的C端。类似的，通过在IgG1的C端加上了IgM的尾部或者在309位引入Cys突变形成IgG 6聚体。通过引入IgM尾部形成的IgG多聚体增强了与FcγRI, FcγRIIa, 和FcγRIIIa的相互作用，与FcγRIIb 和 FcγRIIIb的相互作用减弱了。在众多差异的多聚化设计中，多聚IgG与单体形式相比显著提高了与FcγRI, FcγRIIb, 和 FcγRIII的相互作用。一些分子在临床关节炎模型，神经性病变，及自身免疫造成的重度肌无力治疗中展示出良好的治疗前景。因此，多聚IgG设计可以通过进一步优化使得其可以与FcRn结合以增加半衰期，延长药物作用时间，将更具潜力。
增强补体固定作用
点突变提高与C1q的结合以及增强补体依赖的杀伤作用
抗体可以通过补体途径执行杀伤效应。依赖补体的杀伤作用第一步是已结合抗原的抗体通过CH2结合于补体蛋白C1q。丙氨酸突变扫描显示人类IgG1 Fc段的Asp270, Lys322, Pro329, 和Pro331是Fc结合C1q的必需氨基酸位点。尽管不同物种中Fc与C1q结合的必需氨基酸之间存在差异。为了提高Fc与C1q的结合，Idusogie et al.等人鉴定出Fc中接近Fc与C1q结合核心区域的近端氨基酸为Lys326和Glu333，这些氨基酸也是第一次通过丙氨酸突变扫描首次发现。引入Lys326Ala 和 Glu333Ala突变增加了Fc与C1q的结合，CDC作用也提高了50%。为了优化Fc与C1q结合，在326和333位单独或者引入不同的氨基酸突变。其中，组合突变Lys326Trp 和Glu333Ser将Fc与C1q的结合提高了5倍。然而由该组合突变引起的CDC作用于Lys326Trp单点突变引起的相同，并且Fc也失去了介导ADCC的作用。在将326,333位突变为两个Ala,或者将326,333分别突变为Lys326Met，Glu333Ser在增加了CDC作用的同时并不妨碍ADCC作用。类似的突变被引入铰链区看是否会影响Fc与C1q结合和CDC活性。铰链区的突变并未直观的观察到影响C1q与处于铰链区下游的CH2的结合。然而，上游铰链区Trp替换222,223,224,225 4个位点上的氨基酸，或者组合替换都相应增加了Fc与C1q的结合以及CDC效应。ADCC作用以及与FcγRIIIa的相互作用未受影响。Cys221Asp 和 Asp222Cys单独突变或者结合Trp替代突变也增加了与C1q的结合以及CDC活性。因此，人类IgG1的铰链区调节着CH2与C1q的结合。
为了探究其他突变是否可以增加IgG1的CDC作用，Moore et al.对CD20抗体Fc进行了38种突变优化并在体外通过抗体介导的CDC杀伤Raji细胞对抗体突变体进行了筛选。在这38种突变中编码Ser267Glu, His268Phe, 和Ser324Thr的3个点突变称作EFT突变，该突变产生了更强的CDC作用。CDC最大的改善是将3个点突变整合进1个Fc中。相关分析表明，3个点整合突变增加CDC潜能归因于增加了与C1q的结合。EFT 3点突变同时增加了Fc与FcγRIIb的结合，据此推断，该突变限制了抗体的ADCC和ADCP作用。结合额外的增强ADCC和ADCP作用的突变与EFT突变可以将EFT突变引起的ADCC和ADCP作用的减弱恢复到野生型IgG1状态，但并没有提高。EFT突变引起的与FcγRIIb作用的增强可以通过引入Ser267Glu突变而减弱，然而引入该突变的影响是CDC作用的相应减弱。His268Phe 和Ser324Thr突变结合提高ADCC,ADCP作用的突变创造出一个CDC,ADCC,ADCP作用都有所提升的Fc.该研究重点在于复杂的平衡在优化一种效应功能的同时不能减弱另一种效应功能。
插入或缺失突变引起的与C1q结合增强及CDC作用的增强
铰链区对于C1q识别抗体及抗体样蛋白非常重要。IgG3含有不同于其他亚型抗体由重复的外显子3编码的较长的铰链区。对于IgG3抗体激活补体反应需要缩短其铰链区。但是完全删除铰链区将废除CDC功能，一个含有15个氨基酸残基的铰链区替代野生型IgG3铰链区延伸的62个氨基酸将CDC作用提升了10倍。更特别的是从核心铰链区移除3个重复区并不影响CDC作用，相反提高了抗体介导的CDC抗菌作用。与IgG3相比，在IgG1执行核心铰链区的两个氨基酸的突变将减弱与C1q的结合，影响CDC,ADCC功能。
交叉抗体亚型提高与C1q的结合
IgG1在生物制药中相对于IgG3更有优势，因为IgG3较长的铰链区使得大规模生产复杂化。然而在体外实验中，IgG3具有与C1q最好的结合。为了提高IgG1与C1q的结合，IgG3的结构域被IgG1相关结构域替代产生IgG1/IgG3交叉抗体。这种嵌合抗体由于较长的铰链区使纯化增加了难度，但是同时也增加了IgG3的功能。在一种最佳的突变中称作1133，CH1和铰链区来自于IgG1融合了IgG3的Fc。其ADCC作用和抗原结合能力未改变，而其CDC作用及与C1q的结合都有所增强。另外1133设计在低抗原水平下仍然保持着CDC作用。然而1133设计缺少与ProteinA的结合，这对抗体的纯化增加了难度。因此，一种含有IgG1 CH1,铰链区，CH3结构域，IgG3 CH2结构域的组合被设计了出来，因为C1q结合于CH2结构域而CH3与proteinA结合方便纯化。该突变在增加了CDC作用的同时还可以用proteinA纯化。一种嵌合抗体增强CDC作用分子机制的假设是在CH2结构域中近C1q结合端的氨基酸序列的差异造成Fc三级结构的差异。在突变试验中，旨在确定哪些氨基酸在IgG1,IgG3与C1q的结合中是必须的。K322被发现在两种抗体与C1q结合中非常重要，但是在不同的抗体亚型中依赖不同的额外氨基酸。例如P331在IgG1执行CDC作用中是必须的，但是在IgG3执行CDC作用中影响就不那么明显。这一结果揭示出C1q结合IgG3和IgG1存在差异，因此，嵌合抗体有可能提高Fc与C1q的结合。以上Fc设计的目的是增强IgG1的活性，而有些交叉将沉默Fc的功能。与IgG1和IgG3相比，IgG2,IgG4介导的CDC作用微不足道。但是将IgG2中CH2结构域用IgG3中相应结构域替代将给IgG2植入介导CDC作用的功能。类似的IgG4与IgG1在331位氨基酸存在着差异，这一位点接近C1q的结合位点，将IgG4中331位对应的氨基酸用IgG1中331位氨基酸取代，将恢复IgG4介导的CDC作用到中等水平。因此，如果一个人知道介导效应功能的关键氨基酸残基，并将其引入功能沉默的Fc就会赋予抗体特殊的功能。
IgG1六聚化形式增强了与C1q结合和CDC作用
众所周知，抗体与抗原结合形成聚体是增强与C1q结合的本质。为了在缺少抗原结合时，让IgG也能产生聚体，通过对IgG结构的分析，结果显示345位氨基酸残基有助于不同亚型抗体多聚化。IgG结构分析引入带正电氨基酸有助于Fc与Fc相互作用。因此将Glu345Arg突变引入IgG1。电镜，质谱分析都显示突变IgG1可以产生单体，也能产生聚体。聚体形式的IgG增强了与C1q的结合和更加有效地裂解淋巴瘤细胞。更有趣的是Glu345Arg突变不光增加了IgG1的CDC效应，在IgG2,IgG3,IgG4中也是有效的。IgG1的多聚化也可以通过前面所述引入IgM抗体尾部氨基酸或者引入Cys309突变也可以实现。IgG尾部通过引入IgM尾部氨基酸形成聚体显示可以有效增加与C1q以及C5b的结合。因此IgG多聚化是除了形成IgG1/IgG3嵌合抗体以外的另一种增加与C1q结合的方式。
糖基化改善补体结合
CH2结构域中的Asn297糖基化修饰可以提高CDC作用。在大量筛选的20种异质糖基化的抗三硝基苯酚的IgG1抗体， Fc过度糖基化增加了与C1q的结合和CDC活性。半乳糖基化出现在主要的寡糖残基中影响CDC活性，很明显，Fc丰富的半乳糖基化与CDC正相关。在一项独立的实验中Peschke et al.运用不同的特异性，多种亚型IgG抗体证实了半乳糖基化对CDC活性的影响。体外实验显示半乳糖糖基化IgG1 抗体，CD20 Rituxumab显著增强了CDC作用，有效杀伤Raji细胞。半乳糖糖基化IgG3 Fc也可有效增加抗体的CDC作用，但是在IgG2或IgG4并不适用。通过半乳糖糖基化Fc增加CDC作用并未改变抗体抗原的结合，而是增强了Fc与C1q的结合。IgG1的过度半乳糖糖基化同时也增强了热稳定性（差示扫描量热法）。因此，半乳糖基化Fc是提高产物热稳定性及CDC作用的策略。
提高抗体循环半衰期
除了通过增加与激活型受体FcγR,C1q的亲和力来提高抗体的效应功能外,Fc优化工作也有助于改善抗体在体内的循环。在体内IgG的代谢调控受制于与新生儿受体（FcRn）的结合。FcRn结合在CH2,CH3的连接处，并呈现PH依赖性。IgG被细胞内吞后穿梭进溶酶体或者重新循环出细胞表面。在核内体中，IgG在低PH (pH < 6.5)条件下与FcRn的结合，允许抗体和FcRn一起被转运回细胞表面。在低PH (pH < 6.5)条件下，与FcRn弱结合的抗体被转运至溶酶体，最终被降解。在胞外生理环境中IgG与FcRn亲和力降低，导致IgG被释放，进入再循环。PH依赖的结合通过低PH条件下His310, 435, 436质子化来调节。质子化产生了带正电荷的氨基酸残基结合与FcRn上带负电荷的Glu117, Glu132, and Asp137。
点突变增加Fc对FcRn的亲和力
增加IgG1半衰期的总体的方法仍然是通过丙氨酸扫描突变。最终筛选到17个氨基酸位点突变影响着IgG与Fcn的结合。在这17个关键氨基酸位点中，当Asn434 和 Glu380突变为Ala时，Fc对FcRn的亲和力显著提高。Asn434Ala突变已经被应用于增强Fc与FcRn的结合，因此Asn434Ala突变加上Ser298Ala, Glu333Ala, 和Lys334Ala创造出AAAA突变来增加抗体与FcγR的结合，同时在一定程度上也改善了与FcRn的相互作用（表2）。其它的增加半衰期方法有通过噬菌体文库随机定向进化筛选了出来。噬菌体的结合模拟核内体环境在PH6.0的条件，洗脱条件在PH7.4条件，筛选到在生理条件下不与FcRn结合的突变体。通过不同的分析方法，证实有6种突变可以改善Fc与FcRn的结合，包括Glu294deletion/Thr307Pro/Asn434Tyr称作C6A-66,以及Thr256Asn/Ala378Val/Ser383Asn/Asn434Ty称作C6A-78。Asn434Tyr存在于众多突变筛选结果中。这些收集到的突变之间的一点差异是对于FcγRIIIa结合力不同，因此在执行延长半衰期的突变的时候存在保留或者敲出了ADCC作用的差异。在最近的研究中显示C6A-66突变集中进一步分析发现该突变对FcRn的结合提高趋于中间水平。但是体内实验显示有着最好的血清半衰期。对于突变集的研究类似于个别突变用于揭示Glu294删除对功能的影响。该删除突变也导致了Fc Asn297寡糖的唾液酸化。丰富的唾液酸化是体内增加抗体半衰期必要的。因此，增加与FcRn结合的影响不是产生增加抗体的半衰期的唯一办法。唾液酸化也可以调节抗体的半衰期。
表2.Fc修饰改善抗体半衰期
Ghetie et al.等人也开发了一个大的随机突变库，来筛选小鼠Fc突变增加其余FcRn的结合。其中筛选到三个重要的Fc位点Thr252, Thr253, and Thr254。这三个位点是基于Fc与FcRn结合的近距点。通过噬菌体文库筛选，筛选到Thr252Leu, Thr253Ser, 和 Thr254Phe突变集明显的延长了抗体的半衰期。这种3点突变称作LSF突变，该突变在PH6.0的条件下，对Fc与FcRn的结合速率没有影响，却降低了Fc从FcRn上解离的速率。这项研究结果表明，小鼠抗体252,254,256位氨基酸可以通过人工改造以增加半衰期。因此，在后面的研究中噬菌体文库展示筛选人类IgG1中具有类似功能氨基酸位点突变252,254,256。在人类IgG1突变文库中，Met252Tyr, Ser254Thr, 和 Thr256Glu是最为丰富的突变。这三点突变，通常称作YTE突变,该突变导致Fc与FcRn的解离速率降低了10倍。整体上来讲，YTE突变增加Fc与FcRn平衡常数近3倍。为了验证该突变是否在灵长类动物体内可以改变药物动力学，野生型IgG1和YTE突变抗体被输注到食蟹猴体内，与体外实验一致，YTE突变IgG1在食蟹猴体内半衰期提升了近4倍。另外，在细支气管流动液中也检测到了高浓度的YTE突变抗体。关于YTE突变的IgG1药物药物动力学，双盲实验，剂量爬坡试验正在进行。在该研究中，YTE突变IgG1血清半衰期达到了80-112天。野生型IgG1的半衰期仅21天，YTE突变导致药物半衰期在人体增加了4-5倍。在另外一项研究中，引入YTE突变的motavizumab其半衰期在灵长类动物和人身上结果一致，血清半衰期的确增加了2-4倍。非常显著地是YTE突变抗体治疗的患者，240天后仍然可以检测到输注的抗体药物。因此，YTE突变延长了药物的作用时间，更有效地治疗疾病。YTE突变的确延长了药物半衰期，但是减弱了ADCC作用。由YTE突变引起的ADCC减弱可以通过增强ADCC作用的突变抵消掉，例如DLE突变。因此YTE突变应该用于那些不需要ADCC作用的药物抗体开发。
Zalevsky et al等人另一些关于改善血清半衰期的研究，采用合理的蛋白设计，引入Met428Leu 和Asn434Ser突变称作LS突变，显著的降低了IgG1 Fc对FcRn的解离速率，显著提高在PH6.0条件下Fc与FcRn的亲和力。与YTE突变不同的是LS突变不会明显减少ADCC作用。在食蟹猴中，LS突变增加了药物血清半衰期近3倍。另一项研究发现在人类FcRn转基因小鼠中,LS突变药物的血清半衰期增加了3-4倍。在FcRn转基因小鼠建立的肿瘤移植模型中，LS突变的抗体药物治疗效果也有相应的提高。在以上的两种肿瘤免疫治疗模型中LS突变的IgG1抑制肿瘤增殖效果明显好于野生型IgG1药物。自起初的LS突变，更多的突变研究增加了药物在食蟹猴中的半衰期。在治疗HIV感染的动物模型中，LS突变能持续维持药物抗病毒作用。LS突变的结果还有增加粘膜中抗体浓度和延长半衰期得作用。结合以上的优点，在恒河猴感染HIV病毒的治疗中,LS突变药物治疗效果明显提升。临床实验正在准备引入LS突变的抗体药物治疗HIV感染。LS突变增加的抗HIV病毒抗体药物动力学能否从恒河猴类比到人类还有待验证，是否延长在人类中的半衰期还有待评估。引入LS突变策略的优点在于该突变在生理条件下完全消除了Fc与FcRn的结合，同时增加了低PH条件下二者的结合。
交叉亚型点突变增加FcRn的结合
IgG1药物Fc:FcRn关联的半衰期为21天。不同于IgG1,IgG3在等位基因435位编码的氨基酸为Arg，IgG1为His。IGHG3∗17, IGHG3∗18, and IGHG3∗19等位基因是个例外，他们在435位编码的氨基酸跟IgG1一样为His。Arg435相对于His435抗体血清半衰期仅为7天。体外实验证实含有His435的IgG1对比Arg435的IgG3与FcRn的结合有明显的优势。另外，含有Arg435的IgG3增加了生理条件下与FcRn结合，这就是导致IgG3被表达FcRn上皮细胞清除，阻碍IgG3在血清中再循环的原因。为了增加IgG3的半衰期，将435Arg突变为His，该突变增加了IgG3在低PH条件下与FcRn的结合。与亲和力增加一致的是突变的IgG3血清半衰期和有效性都有所提高。因此，调节IgG3 PH敏感性是增强其血清半衰期的机制。
抗体Fc工程化设计消除其效应功能
虽然Fc的优化重点关注在获得功能性改善，然而在某些特定情形下消除抗体Fc功能更有益。这些情形包括抗体用作（1）受体激动剂，诱导细胞信号，（2）受体拮抗剂，阻断受体和配体的结合，抑制信号或（3）作为药物载体递送药物到表达相应抗原的靶细胞（图1C,D）。在以上的几个例子中，Fc与效应细胞受体的结合，以及Fc与C1q的结合都是无意义的。因为如果保持着Fc功能将导致抗体药物误伤表达相应受体的细胞，以及造成抗体偶联药物脱靶情况下误伤重要的免疫细胞。接下来，将描述一些关于消除与FcγR，C1q结合的设计策略。
表3.Fc修饰沉默Fc的效应功能
消除与FcγR的结合
点突变废除与FcγR的结合
最早用于抑制移植排斥反应的单抗药物为OKT3。尽管对抗体进行了人源化，但抗体诱导的炎症因子释放将造成细胞毒性。细胞因子的释放归因于OKT3结合与T细胞上的CD3,随后Fc又与 FcγR结合。为了消除抗体Fc与T细胞FcγR结合造成的细胞因子释放，需要对Fc进行突变。一个点突变Leu235Glu足以敲除Fc与U937细胞表面受体的结合。此外，IgG1 Leu235Glu突变在降低FcγR结合力100倍的同时也降低了T细胞激活和增殖。结合起初的Leu235Glu突变，Leu234Ala 和 Leu235Ala突变称作LALA突变，消除了Fc与FcγRIIa的结合（表3和图3A）随后的研究表明，在IgG1和IgG4中LALA突变消除了与FcγRI, IIa, 和 IIIa的结合。LALA突变的确比Leu234Ala或Leu235Ala单点突变更为有效。一些研究表明Leu235Glu单点突变消除了Fc与FcγRI的结合。然而，另有一些研究表明，由于Fc与FcγRI的高亲和力，仍然有突变体与FcγRI结合。类似的，Leu234Ala单点突变仍有突变体与FcγRI结合。234,235位单点突变和双突变都减弱了PBMC介导的ADCC作用，几乎消除了猴子中的ADCC作用。尽管如此，LALA突变在人类已经进入临床Ⅰ期试验。包含LALA抗CD3抗体OKT3被用于肾脏移植造成的急性排斥反应。包含LALA突变的IgG1引起的副反应更小，逆转了6-7例肾移植患者的排斥反应。一个普遍的配对，除了LALA突变，Ser228Pro结合Leu235Glu,突变称作SPLE突变或者PE突变，SPLE突变被引入了IgG4,这导致Fc与FcγR结合非常弱，对于IgG4来说，其与FcγR的结合本来就相对较弱，这可能要归因于IgG4中Phe234不同于IgG1中的Leu234。这种引入SPLE突变显著降低了IgG4与FcγRI的结合，几乎降低到了SPR的检测极限，该突变并不影响抗体在大鼠体内的半衰期。Ser228Pro突变还被认为可以显著改善IgG4的稳定性。
LALA突变已经为其他突变或者新的Leu235.修饰提供了基础。在LALA突变的基础上，Oganesyan et al等人突变了Leu234 和 Leu235，并额外突变了Pro331Ser，完全废除了Fc与FcγRs的结合。Pro331Ser, Leu234Glu, and Leu235Phe三点突变在改变了与FcγRs的结合外，并没有影响Fc的空间构象。类似的Pro329Gly加上LALA突变抑制了鼠源IgG2a与FcγRI, II, 和III的结合。329位氨基酸的改变，因为该位点氨基酸残基涉及与FcγRIIIa Trp108 和 Trp131的相互作用。LALA-PG突变优于单独的LALA突变，该突变完全消除了小鼠和人Fc的效应功能。而仅仅是LALA突变仍然保留了鼠源IgG2a抗体与FcγRIII的相互作用。LALA-PG突变的重要意义在于由于鼠源IgG2a与人类IgG1的相似性，该突变在小鼠模型上的结果可以准确类比转移到人类身上。
LALA突变使最为广泛的点突变用于干扰Fc与其受体的结合，然而，也存在其它点突变可以完全消除Fc与其受体的结合。Lund等人运用丙氨酸扫描突变对IgG 32个位点突变，结果显示Gly237和 Glu318是FcγRII结合的必需氨基酸。这两个位点的缺失将造成吞噬作用的大幅减弱。其他丙氨酸扫描突变显示存在9个决定性的氨基酸可以让Fc丧失与FcγRI, IIa, IIb,和 IIIa结合的能力。尤其是Asp265Ala 和 Glu233Pro突变将影响Fc与FcγRI, IIa, IIb,和 IIIa结合能力下降＞80% 。Ala318, Ala237, Ala265,和 Pro233代表着一个突变集，可以用来做各种组合突变来消除Fc与其受体的结合。
图3.沉默Fc功能的策略
Fc交叉亚型设计消除与FcγR的结合
为了沉默Fc的效应功能，不同亚型抗体Fc区域的大片段交换产生交叉Fc区域。这些设计结合不同亚型Fc作用不冲突的CH区域，旨在完全沉默Fc的效应功能。例如IgG2具有与FcγR弱结合但结合C1q的作用，但IgG4缺少与C1q结合但与FcγRs结合的作用。因此结合IgG2和IgG4 CH的特点构建出缺乏与C1q,FcγR结合的交叉抗体。特别的，在IgG2/G4嵌合抗体中铰链区和CH1来自于IgG2,CH2,CH3来自于IgG4。
运用不同的方法达到同样的目的，另一些学者类比不同亚型IgG的差异，并将突变引入IgG2产生完全消除与FcγR结合的作用。该方法的目的是向Fc引入天然的氨基酸以免产生免疫原性。一些研究者向交叉抗体的IgG2原始序列中引入保守突变产生His268Gln/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser突变体。该突变体称作IgG2m4，缺乏与FcγR的结合。在恒河猴中，该突变抗体的半衰期与野生型IgG类似，这就意味着将IgG4的部分氨基酸一致进IgG2并没有引起过多的免疫反应。
最近，Vafa结合25年前的发现，结合众多突变位点构成称作G2σ的突变（图3B）。该结构包含Val234Ala/Gly237Ala/Pro238Ser/His268Ala/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser突变。而这些突变位点中多数突变位点是为了建立沉默突变的，将其引入IgG2m4嵌合体。在直接比较了与IgG1, IgG2, IgG4, 和 IgG2m4结合FcγRI, IIa,和IIIa的相互作用，发现IgG2σ消除了与以上所述受体的结合。然而，体外实验显示，IgG2m4和IgG2σ 缺少 PBMC效应细胞介导的ADCC作用和几乎微乎其微的ADCP租用杀伤乳腺癌细胞。鉴于IgG2σ废除Fc作用的成功，将该突变引入IgG1和IgG4. IgG1σ(Leu234Ala/L235Ala/Gly237Ala/P238Ser/His268Ala/Ala330Ser/Pro331Ser), IgG2σ和拥有S228P/Phe234Ala/Leu235Ala突变的IgG4（称作IgG4 PAA）在众多物种中有类似的与FcγRs结合的作用。IgG1σ和 IgG2σ缺少与FcγRI和 III结合的作用。对于与Fc弱结合的FcγRIIa和IIb，IgG1σ和 IgG2σ即使在很高的浓度下都只有微弱地结合。IgG1σ和 IgG2σ相比与IgG4 PAA，与FcγRs的结合都相对较弱。IgG4 PAA在与FcγRs结合中也显示了种属特异性，而IgG1σ和 IgG2σ缺乏与人类，恒河猴，小鼠FcγRs结合的作用。因此IgG1σ和 IgG2σ是更为有效的敲出Fc功能的突变体。
Mimoto et al等人用表达FcγRIIb的B细胞上的FcγRIIb捕获免疫复合物。因此，他们工程化Fc，筛选到与FcγRIIb结合增加200倍，与FcγRs亲和力降低10倍左右的Fc结构。该设计提高了Fc与FcγRIIb的亲和力，改善了B细胞向T细胞递呈抗原肽的能力。因为FcγRII为抑制性受体，该突变可以用与需要改变激活与抑制比例改变的实例中。
废除与C1q的结合，减少CDC作用
点突变废除补体结合
诱导补体级联反应也是抗体药引起不良反应的一种形式。因此，消除与C1q的结合 --依赖于抗体补体激活反应起始事件，已经被作为一种优化Fc的目标。一种消除与FcγR结合的有益突变往往可以消除与C1q的结合。在以结构为指导的Fc突变筛选中，Ala330Leu突变被证实可以减弱与C1q的结合。就像之前所述的消除与FcγRIIb的结合。体外试验显示，Ala330Leu突变降低了抗体通过CDC作用对靶细胞的杀伤，可能要归因于Ala330Leu突变干扰了Fc与C1q的结合。然而并不是，所有引入330的氨基酸都可以改变Fc与C1q的结合，所以，330位点只有引入特异的氨基酸才能引起与C1q结合的减弱。需要注意的是Ala330Leu突变是系列突变DLE (Ser239Asp Ile332Glu Ala330Leu) 突变中的一个点，该突变为了改善FcγR介导的效应功能。DLE优化减弱了抗体介导的CDC作用，该效应可以通过删除Ala330Leu突变得到挽救。在一项实例中具有CDC作用的抗体会引起不良反应，为此，引入DLE突变可以增加FcγR介导的效应功能，消除注射位点的不良反应。
其他通过丙氨酸扫描减少与C1q的结合被鉴定了出来。Asp270, Lys322,Pro329和Pro331都是IgG结合C1q的关键位点。在这些位点中，Asp270Ala 和Pro329Ala,显得更加突出，该突变更有利于补体激活反应缺陷和高血清C1q的弱结合。Leu234Glu/Leu235Phe/Pro331Ser三点突变的Fc缺少与FcγRs的结合，同时减弱了与C1q的结合。类似的，IgG2m4不光消除了与FcγR的结合，但同时也消除了也C1q的结合。Vafa et al.等人检测了IgG2m4(His268Gln/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser) 和 IgG2σ (Val234Ala/Gly237Ala/Pro238Ser/His268Ala/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser)结构的Rituxan抗体药物的CDC活性。两种形式的抗体都不能借助人类补体系统的CDC作用杀伤淋巴瘤细胞，这就意味着两种形式的抗体都消除了补体介导的功能。IgG2σ Fc的晶体结构显示其开放的构象意味着CH2结构域之间的空间距离相当大。此外，当looP环中包含Leu328时，Fc的构象又回归到野生IgG2的状态。因此，可以推断Fc空间构想的改变产生于Asp270 和Pro329的重定向，最终导致了IgG2σ Fc与FcγR和C1q结合的减弱。
交叉亚型Fc废除补体激活反应
IgG亚型与补体相互作用的基础知识很好的解释了CDC效应。例如IgG2拥有中等到低水平的CDC效应。因此为了降低IgG3的CDC效应，IgG2的CH2结构域可以用来替代IgG3的CH2。类似的，由于IgG4 包含Ser331而缺乏CDC作用，因此，为了废除IgG1 CDC作用，可以将IgG1进行Pro331Ser突变。这些例子都很好的揭示了基础科学研究如何运用于抗体生物制品的设计。存在很多的交叉亚型突变用于敲出C1q的结合。（表3）
糖工程学废除FcγR 和C1q结合
IgG的297位含有N连接的糖基化位点。（图3C）。典型的N297为双角的寡糖复合物。对该位点糖基化修饰的改造使其富含甘露糖残基将的IgG1 Fc降低与C1q的结合，相应的CDC作用减弱。抑制半乳糖糖基化或唾液酸修饰并不能沉默抗体Fc介导的效应功能。当寡糖中缺乏半乳糖或者唾液酸时，抗体功能正常，Fc突变可以敲出与C1q和FcγRI结合，但同时也增加了Asn297寡糖中，半乳糖和唾液酸残基的清除。Phe241Ala, Val264Ala, 和 Asp265Ala的点突变中也会引起半乳糖和唾液酸残基修饰的增加。糖基化形式的改变是否是减弱与C1q结合，或者由无关的旁观效应引起，至今还不明确。在一项研究中，唾液酸化的Fc与C1q的结合减弱了4倍，这也就预示着高度唾液酸化会直接损坏CDC效应。然而，高度唾液酸化修饰最终降低了糖基化修饰的复杂度，最终影响了与C1q的结合。
另一个普遍消除Fc效应功能的方法是对297位糖基化位点进行突变，例如用Ala,Glu,或Gly代替297位的Asn。移除糖基化位点显著降低了IgG1与FcγRI 和 C1q的结合。在IgG3中Fc缺乏糖基化位点，含有糖基的Fc降低了与FcγRI 和 C1q的结合。在体外实验中，含有去糖基的IgG3失去了通过与FcγRIIIa结合介导的ADCC作用。但是，在小鼠中,移除Asn297的糖残基并不能消除Fc与Fc受体的结合。另外，有人认为可以通过突变Asn297来克服Fc与FcγRI亲和力弱的趋势。因此，在广泛表达FcγRI的单核细胞和巨噬细胞中Asn297Gly突变并不足以消除Fc与FcγRI的结合。Lo et al等人结合Asn297Gly和Asp265Ala突变进一步减弱与FcγR的结合。如上面关于减少与FcγRI 和 C1q的结合的突变，单独或者结合突变可以进一步降低与FcγRI 和 C1q的结合。例如Asn297Gly/Asp265Ala的结合突变几乎敲出了Fc与FcγRI 和 C1q的结合。
关于去糖基化降低与FcγRI 和 C1q结合的机制还不明确。去糖基的Fc易于被蛋白酶降解，这就意味着去糖基的Fc与糖基化的Fc在结构上是有差别的。核磁共振的研究结果也显示出去糖基化的Fc结构发生了改变。最有力的关于去糖基化影响Fc结构的证据是不含N297寡糖小鼠Fc晶体结构。CH3结构域几乎是一致的，但是去糖基化和糖基化的CH2相差10-14Å。去糖基化的CH2结构更加紧密，因此去糖基化的Fc空间构象更加紧密，这种去糖基化引起的结构紧密的现象不是小鼠独有的。当对去糖基化的人类IgG1和IgG4结晶时，结果显示去糖基化的CH2结构更加僵硬，CH2之间的距离靠近移动了10-20Å（图3C）。去糖基化的Fc至少部分的介导扰动了C’E loop。总之，去糖基化导致了Fc构想更加紧密，起到了沉默Fc效应的功能。
结论
多种方法，包括噬菌体文库，丙氨酸扫描，结构设计都可以用于对基于抗体的生物制品Fc进行优化。优化Fc的目的旨在调节其与Fc受体，C1q,FcRn的关系。这些关系可以通过点突变，插入，敲出氨基酸，修饰糖基化组成，甚至增补蛋白结构域来调节。总体来说，加强或者减弱Fc与其结合搭档的相互作用，体外的实验结果都能很好的指导，预测，转移到体内的实验中。对Fc特殊功能的优化不仅仅是为了改善其在体内的功能，也是更好的理解，评估Fc的功能，以及在疾病治疗中的应用。
原文来源：
Saunders KO.Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life.Front Immunol. 2019 Jun 7;10:1296.