科研 | AGING：借助WGCNA共表达分析发现新的膀胱癌生物标志物（国人作品）
编译：Tigobin，编辑：十九、江舜尧。
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膀胱癌干细胞(BCSCs)具有自我更新和分化能力，可能与膀胱癌的发生、转移、复发和耐药有关。然而，BCSCs的潜在作用机制仍有待阐明。本研究通过对膀胱癌患者标本的转录组芯片数据分析，描述了膀胱癌干细胞和膀胱癌非干细胞(BCNSCs)中差异表达的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs。CircRNA_103809是膀胱移行干细胞中最高表达的CircRNA，它作为miR-511海绵促进膀胱癌的自我更新、迁移和侵袭能力。此外，GO和KEGG通路分析表明，所鉴定的差异表达基因可能与癌细胞的细胞代谢、分化和转移调控有关。WGCNA构建的lncRNAs/mRNAs和CircRNAs/mRNAs共表达网络揭示了BCSCs中非编码/编码RNA的调控模式。值得注意的是，作为网络中的核心基因，AHCY、C6orf136和LRIG1显示出很高的预测膀胱癌的潜力。因此，深入研究BCSCs中非编码RNA的功能机制，对于发现膀胱癌的发病机制和发现新的生物标志物具有重要意义。
论文ID
原名：Cancer stem cell-specific expression profiles reveal emerging bladder cancer biomarkers and identify circRNA_103809 as an important regulator in bladder cancer
译名：肿瘤干细胞特异性表达谱揭示了新出现的膀胱癌生物标志物，并确认CircRNA_103809在膀胱癌中是一个重要的调节因子
期刊：AGING
IF：5.51（2018影响因子）
发表时间：2020年
通讯作者：吴松
通讯作者单位：深圳大学
DOI号：10.18632/aging.102816
实验设计
在这项研究中，研究者首次展示了与BCSCs相关的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的表达谱和相互作用网络。根据3例膀胱癌标本的两个微阵列的RNA表达数据，分析了BCSCs与BCNSCs之间的差异表达的CircRNAs、lncRNAs和mRNAs。然后选择在BCSCs中表达最高的CircRNA为CircRNA_103809，对其功能进行进一步的研究。以GO和KEGG途径富集分析研究这些差异表达RNA调节的生物学途径。构建共表达网络，展示BCSCs内潜在的重要相互作用网络。
结果
1. BCSCs中mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的差异表达谱。
为了鉴定与BCSCs功能相关的基因，研究者对从3例BC患者分离的人BCSCs(BCMab1+CD44+)和BCNSCs(BCMab1-CD44-)进行了转录组芯片分析。本研究的工作流程如图1所示。通过数据预处理，构建了3对BCSCs和BCNSCs样本的表达矩阵。图2分别显示了总mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的表达热图。火山图用于评估BCSCs和BCNSCs之间的基因表达差异(图3)。共有2849个mRNAs、2698个lncRNAs和127个CircRNAs差异表达，P值<0.05，倍数变化>2.0。与BCNSCs相比，BCSCs高表达1685个mRNA，1309个lncRNA和113个circRNA，而BCSC中低表达1164个mRNA，1389个lncRNA和14个circRNA。系统聚类分析表明，这些RNA在不同样本中的表达存在系统性差异(图4)，并表明在BCSCs中mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的表达与BCNSCs中的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的表达不同。
图1.膀胱癌干细胞中mRNAs，lncRNAs和circRNAs分析的研究流程。
图2.所有表达的mRNAs、lncRNAs、CircRNAs的分层聚类。对3对膀胱癌样本(BCSC与BCNSC)表达的mRNAs(A)、lncRNAs(B)和CircRNAs(C)进行非监督分层聚类。
图3.分析了BCSCs和BCNSCs之间差异表达的mRNA(A)、lncRNAs(B)和CircRNAs(C)。
图4.表示差异表达的mRNAs（A），lncRNAs（B）和circRNAs（C）的热图。
2. 表达非编码RNA的BC的结构特征和染色体分布。
在所有表达的lncRNA中，基因间和天然反义lncRNAs的数量分别最多(图5A)。而在所有表达的CircRNA中外显子和内含子的CircRNA数量最多(图5B)。此外，对24条染色体上CircRNAs分布的分析表明，膀胱癌细胞中表达的CircRNAs主要分布在ChR1和Chr17上(图5C)。
图5.差异表达的lncRNAs和circRNAs的特征分析。(A)差异表达的lncRNAs(BCSCs与BCNSCs)根据其邻近基因的基因组位置可分为6类。该柱的灰色部分和黑色部分分别表示BCSCs中上调和下调的lncRNA。（B）差异表达的circRNAs（BCSC与BCNSC）根据其邻近基因的基因位置分为5类。(C)根据CircRNAs在人类染色体上的位置对差异表达的CircRNAs计数进行分类。
3. 差异表达的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs的验证。
图6.微阵列和qRT-PCR结果的比较。由癌球形成的膀胱癌细胞系EJ（A）和T24（B）检测到的6种mRNAs（XAGE5，COX7B2，MAGEB2，BHMT，PROM1和SLCO1B3），6种lncRNAs（RP11-332K15.1，XX-CR54.1，BC038578，LOC389023，SSTR5-AS1和FAM99A），和6种circRNAs（hsa_circRNA_103809，hsa_cirRNA_101368，hsa_cirRNA_102399，hsa_cirRNA_000639，hsa_cirRNA_001547和hsa_cirRNA_400010）的qRT-PCR结果与从微阵列获得的表达数据进行了比较。红色柱表示从微阵列获得的倍数变化值，黑色柱显示qRT-PCR的倍数变化值。
4. circRNA_103809充当miR-511的海绵并诱导膀胱癌进展。
研究者用覆盖circRNA_103809的反向剪接区域的两个siRNA敲低了膀胱癌细胞中circRNA_103809的表达，并通过qRT-PCR确认（图7A）。结果发现，circRNA_的沉默显著降低了膀胱癌细胞的肿瘤形成、迁移和侵袭能力（图7B-7D）。这些结果表明，circRNA_的低表达可能能够减少BC的进展。为了验证circRNA_103809是否充当这些miRNA的结合平台，研究者在EJ细胞中进行了RNA下拉测定。如图7E所示，研究者首先确定了miRNA在EJ细胞系中的表达。然后，作者使用circRNA_103809探针下拉内源的不同miRNA，我们发现circRNA_103809在EJ细胞中仅特异性富集了miR-511（图7F）。
图7. circRNA_103809通过使miR-511海绵化来诱导膀胱癌进展。（A）qRT-PCR分析EJ细胞中siRNA转染的转染效率。 circRNA_103809的表达不足会导致肿瘤球减少（B），迁移（C）和侵袭（D）能力降低。 （E）EJ细胞中miR-130，miR329，miR511，miR532和miR-642表达的qRT-PCR分析。 （F）对EJ细胞裂解物进行RNA下拉测定。 miR-511可通过circRNA_103809探针下拉。
5. 差异表达RNA的生物学过程和富集途径。
GO网络和图表是从Gene Ontology富集分析获得的（图8）。GO分析差异表达的mRNA，lncRNA和circRNA。对上述基因集进行的KEGG分析显示BCSC中差异表达的mRNA，lncRNA和circRNA的相关的途径（图9）。对于mRNA，药物代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢和类固醇激素的生物合成被确定为KEGG的最高富集途径(图9A)。脂肪和代谢、泛酸和辅酶A的生物合成、乙醛酸和二羧酸的代谢是lncRNA最显著的富集途径(图9B)。显著富集的途径是半胱氨酸和蛋氨酸代谢、hedgehog信号和circRNAs紧密连接（图9C）。
图8.对差异表达的mRNAs、lncRNAs和circRNAs进行GO分析。
图9.差异表达的mRNA（A），lncRNA（B）和circRNA（C）的KEGG途径富集。KEGG通路散点图显示了BCSC和BCNSC之间通路富集的统计信息。
6. BCSCs中lncRNA-mRNA和CircRNA-mRNA共表达网络的研究。
mRNAs和CircRNAs共表达网络由66个网络节点和1088个连接组成，该网络包括6个mRNAs，CARHSP1，DOCK7，GFI1B，PARD6A，RAB3IL1和SPNS3，它们可能构成网络的核心(图10A)。同时，mRNAs和lncRNAs共表达网络由39个网络节点和380个连接组成，该网络包括13个mRNAs，Adal，BCAT1，IL19，KIAA0748，NR2E3，PRSS22，SCARB1，SMPD1，ZNF319，ALDOA，AHCY，C6orf136和LRIG1(图10B)。在TCGA膀胱癌数据库中分析了这些核心基因的表达与患者生存预后的关系。AHCY、C6orf136和LRIG1高表达组与低表达组的总生存率和无病生存率比较差异均有显著性(图11，P<0.05)。因此，AHCY、C6orf136和LRIG1的表达水平可作为预测BC患者生存期的指标。
图10.通过加权相关网络分析构建共表达网络。不同颜色的点用于显示不同类型的基因，黄色表示mRNA，红色表示lncRNA（A）或circRNA（B）。
图11.使用TCGA的膀胱癌数据分析AHCY(A)、C6orf136(B)和LRIG1(C)的总体生存率和无病生存率。
结论
通过对膀胱癌患者标本的转录组芯片数据分析，描述了BCSCs和BCNSCs中差异表达的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs。CircRNA_103809是膀胱移行干细胞中最高表达的CircRNA，它作为miR-511海绵促进膀胱癌的自我更新、迁移和侵袭能力。此外，GO和KEGG通路分析表明，所鉴定的差异表达基因可能与癌细胞的细胞代谢、分化和转移调控有关。WGCNA构建的lncRNAs/mRNAs和CircRNAs/mRNAs共表达网络揭示了BCSCs中非编码/编码RNA的调控模式。值得注意的是，作为网络中的核心基因，AHCY、C6orf136和LRIG1显示出很高的预测膀胱癌的潜力。
评论
研究者从3例临床膀胱癌标本中筛选出差异表达的mRNAs、lncRNAs和CircRNAs，并对其进行了分析。共有2849个mRNAs、2698个lncRNAs和127个CircRNAs在膀胱癌细胞中差异表达，并调控其相关基因的表达，在膀胱癌细胞的茎性维持中发挥重要作用。这些RNA的相关信号通路为进一步研究膀胱癌发生和发展的详细机制奠定了基础。目前的工作也提出了需要进一步研究代谢过程，特别是与药物代谢相关的代谢过程，以揭示膀胱癌干细胞的化疗耐药机制。
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