玩转NGS实验室 | 第二期：如何建设高通量测序实验室（上）
高通量测序 (Next Generation Sequencing，NGS) 技术因其通量、成本和效率等各方面的优势，在肿瘤、遗传病及病原微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。随着相关临床研究的持续深入，政策法规的引导与完善，进一步推动了该技术在院内本地化的应用。“玩转NGS实验室”专栏旨在从多角度探讨NGS技术院内本地化应用的相关规范、应用项目及重要进展，推动NGS技术的临床转化。
临床实验室的规范化建设和标准化管理是技术应用的先决条件。目前开展高通量测序（NGS）检测的实验室主要依据是参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。实验室的总体设计与要求参考《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》进行、《高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（肿瘤部分）》、《国家卫生计生委关于印发医学检验实验室基本标准和管理规范（试行）的通知》等相关规范。[1-6]
高通量测序实验室又称NGS实验室，以高通量测序技术为主要检测手段，完成临床疾病筛查或辅助诊断等项目。
NGS实验室建设的基本条件[1-5]
01
实验室要求
实验室建设符合临检中心的相关规定。依据卫办医政发［2010］194号文件《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》，实验室在通过省级卫生行政部门相应技术审核和登记备案后，方可开展临床检测工作。
02
实验室开展项目
实验室拟开展的NGS检测项目必须基于医学科学证据，有明确的临床预期用途，例如疾病鉴别诊断或辅助诊断、治疗药物选择、预后判断等。检测申请单、结果分析、解释和临床决策必须基于医学科学证据。
03
实验室检测设备
实验室应配备满足临床检测项目需求的仪器设备。选择国家药品监督管理局（NMPA）批准的高通量测序仪及配套服务器，高通量测序检测试剂盒，自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。
04
实验室使用试剂
实验室应优先选择国家药品监督管理局（NMPA）批准的试剂，或经过审核后具有严格标准操作规程（SOP）的自配试剂（LDT），所建立的LDTs试剂禁止商品化或在其他实验室使用。
所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合国家卫生计生委临床检验中心、IFCC、WHO等推荐的方法性能。
所用标准品或标准参考物符合国家卫生计生委临床检验中心推荐的标准和要求。
05
实验室人员资质要求
实验室应具有可满足开展检测要求的有关的临床病理学、分子生物学相关专业教育背景、工作经验的医学和生物学等专业人员。
实验室人员必须参加充分的内外部理论和技能培训并通过考核，同时具有临检中心《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》。
数据分析人员应具有临床医学、分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。
最终报告签发人员应具备医学分子生物学知识背景，熟练使用相关数据库，掌握本领域的指南，了解相关研究的最新进展。
06
实验室制度管理
必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立质量管理系列文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。
07
实验室环境要求
NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。
NGS实验室的分区
《高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识（第一版通用部分）》表示：高通量测序操作步骤多、程序复杂，分为“湿实验（wet bench）”和“干实验（dry bench）”两个阶段：
“湿实验”包括样本预处理、核酸提取、基因组的片段化、建库、扩增、靶序列富集、混样、测序前准备及测序等；
“干实验”包括测序后的数据质量分析、比对、变异识别、注释和结果报告与解释等环节。[5]
图1.肿瘤诊断技术流程图[9]
NGS的实验室比常规PCR实验室有更高的要求，NGS项目检测中肿瘤诊断与治疗的要求最为严格。实验室需根据拟开展的检测项目数量、检测技术流程、测序平台和工作量大小来制定实验室分区设计的方案。
根据常规NGS操作步骤，NGS实验室大致可分为以下区域：
（1）试剂储存和准备区;
（2）样本前处理区；
（3）样本制备区;
（4）文库制备区;
（5）杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）：
（6）纯化一区；
（7）文库扩增区（第二扩增区）;
（8）纯化二区；
（9）测序区;
（10）洁净走廊及污染走廊区域。[1],[7-8]
图2.肿瘤NGS诊断实验室平台主要区域及流转示意图[9]
只有规范设置实验区域， 才能降低或者避免实验中可能出现的污染[10]。
NGS实验室的规范化建设和标准化管理极大保障并推动了技术的临床转化应用。
参考文献
[1] 《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》编写组. 临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识[J]. 中华病理学杂志, 2017, 46(003):145-148.
[2] 中华医学会病理学分会，中国医师协会病理科医师分会，中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会，等. 分子病理诊断实验室建设指南（试行）[J]．中华病理学杂志，2015, 44(6): 369-371. DOI: 10. 3760/cma. J. issn. 0529-5807. 2015. 06. 001.
[3] 中华人民共和国卫生部． 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法[S]. 2010-12-06.
[4] 中华人民共和国卫生部． 肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）[S]. 2015-7-31.
[5] 北京市临床检验中心,北京医学会检验医学分会,首都医科大学临床检验诊断学系,北京市医学检验质量控制和改进中心. 高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识(肿瘤部分). 中华医学杂质, DOI:10.3760/cma.j.issn.0376‑2491.2019.43.008.
[6]北京市临床检验中心 北京医学会检验医学分会 首都医科大学临床检验诊断学系 北京市医学检验质量控制和改进中心.《国家卫生计生委关于印发医学检验实验室基本标准和管理规范（试行）的通知》《中华医学杂志》 2020年09期
[7] 中华人民共和国卫生部. 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法[S]. 2010-12-06.
[8] 分子病理实验室设计要求及体会[J]. 诊断病理学杂志, 2018, 25(11):57-58.
[9] 李金明主编. 高通量测序技术. 北京：科学出版社, 2018.12.
[10] 上海交通大学医学院附属瑞金医院. 第二代测序技术在肿瘤诊疗中的应用及其价值与风险[A]. 检验医学, 1673-8640（2017）04-0245-05. 10.3969/j.issn.1673-8640.2017.04.001.
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