基于重组杆状病毒/昆虫细胞系统VLP生产的上游工艺流程
前
序
“Novavax Is Now the Best COVID-19 Vaccine”，新冠疫苗NVX-CoV2373优异的临床数据，使杆状病毒/昆虫细胞表达系统（BEVS/IC）在病毒样颗粒(VLP)制备中表现出色，和Novavax公司相伴隆重进入行业视野。接下来我们以NVX-CoV 2373的上游工艺概述作为本文开篇。
#01
NVX-CoV 2373及其重组表达基本信息
NVX-CoV 2373是由COVID-19病毒的全长S结构蛋白，经BEVS/IC 系统重组表达组装而成的有包膜纳米颗粒疫苗（属亚单位/VLP）。
NVX-CoV 2373 VLP生产及重组杆状病毒Stock制备宿主细胞为Sf9昆虫细胞，悬浮培养于无血清培养基SFX-Insect medium (HyClone) 中；病毒Stock制备流程中BEVS感染的MOI<0.01；S蛋白的重组表达时：接毒活细胞密度 (CCI)为2–3×10e6 cells mL−1，MOI<0.1，TOH为68–72 h。
#02
Novavax 公司的BEVS/IC系统VLP生产概况
在NVX-CoV2373之前，Novavax已经拥有丰富的基于BEVS/IC系统的VLP疫苗管线，2020年3月Novavax宣布其四价流感纳米颗粒疫苗NanoFlu，在关键性III期研究中达到了主要终点和次要终点。
因为NVX-CoV2373疫苗，Novavax已经或正在计划与全球范围多家CDMO合作，但目前Novavax仅在美国的Rockville 拥有10,000ft2 中试基地，每周可生产2-3 百万剂单价流感疫苗。该基地培养上游生产设备包括一台Cytiva Xcellerex 1000L生产反应器；Seed Train由两台Cytiva Wave反应器，及一台Cytiva Xcellerex 200L反应器构成。
BEVS/IC 在人用和兽用预防和治疗领域的应用已有多年历史，是VLP（有包膜/无包膜）生产最常用的表达系统。2009年10月FDA 批准上市的葛兰素史克的宫颈癌疫苗 Cervarix， 是首款以BEVS/IC为表达系统的人用VLP疫苗。2013上市并被世卫组织列入年度流感疫苗的Flublok VLP疫苗，也产自BEVS/IC系统。
利用BEVS/IC系统生产VLP的上游工艺，包含穿梭质粒构建，重组杆状病毒Stock制备，及目标蛋白重组表达和VLP组装等多个步骤。昆虫细胞培养及重组杆状病毒Stock感染对数生长期的昆虫细胞，是BEVS/IC系统上游工艺的核心部分和工艺建立的重点。
一、 昆虫细胞培养工艺的建立
1. 细胞培养设备及规模
昆虫细胞规模化培养主要采用连续搅拌式生物反应器（CSTR）。VLP结构多样，可由单一或多至3-4个结构蛋白构成，不同VLP产量差异巨大，基于BEVS/IC系统的VLP 产量可以从 0.2 mg/L 到数百 mg/L 不等（如表1所示）。因此基于BEVS/IC系统VLP生产工艺建立中重要的考量点之一，是根据VLP产量确立细胞培养规模。
表1. 基于BEVS/IC系统VLP举例
2. 细胞培养参数的建立
在已批准的活性药物成分 (API) 中，以昆虫细胞为宿主生产的仅占一小部分（约 2.3%）。因此目前昆虫细胞培养工艺的建立，通常是在较为成熟的CHO系统的技术和操作策略基础上进行的修改和调整。这些调整中有些简单易行，比如最适培养温度，最适pH范围等参数可直接按照昆虫细胞的实际情况进行调整。搅拌速度及通气策略的建立，则需综合考量细胞的剪切力耐受及耗氧等方面因素。目前已知Sf9昆虫细胞和High Five昆虫细胞的比耗氧率比 CHO 细胞高分别出4倍和 13 倍，感染后会进一步增加 30-40 % 。因此满足巨大的氧需求是昆虫细胞生物反应器培养工艺建立的重点。
A
经典CSTR搅拌和通气策略设计
CSTR搅拌和通气策略设计需要平衡细胞剪切力和气体传输效率， 当前主流昆虫细胞培养CSTR 搅拌参数设计，沿袭了CHO细胞的策略：以刚好满足混合要求的低搅拌速度运行，尽量降低搅拌带来的剪切力；通过通气方式、速率和所供应气体的成分控制来满足细胞的耗氧需求。
B
针对性改进策略
按照上述经典思路，为了满足昆虫细胞巨大的氧耗，往往需要以较高流速通入纯氧。这样会导致许多问题：高流速气体会在系统中产生很多气泡，液体表面气泡的破裂，又进而导致泡沫产生和剪切增加；低搅拌速度可能带来的混合问题；在混合有限的情况下，纯氧会导致细胞中的氧化应激，进而影响工艺效率等等。
上述策略是基于昆虫细胞高剪切敏感性的假设。为了应对上述问题，有人尝试反其道行之：即通过提高搅拌速度增强培养体系的气体传输，来满足昆虫细胞巨大的耗氧需求。结果显示，昆虫细胞的剪切力耐受远高于之前的假设；工艺中随着培养进程中细胞不断加大的耗氧而提高搅拌转速，既解决了低搅拌速度会导致混合问题，也避免了高速率通入高比例纯氧带来的一系列问题，从而使培养工艺更加稳健易控（图1）。
图1. 搅拌速率与通气策略欧联的DO控制策略
二、 感染流程的主要影响因素及优化
BEVS/IC系统生产VLP上游流程中的病毒Stock制备和VLP生产，都是通过重组杆状病毒对昆虫细胞的感染实现的。MOI (multiplicity of infection), TOH (time of Harvest) 和CCI (cell concentration at infection) 等，是感染环节的几大关键参数。
1. MOI
最佳 MOI 通常取决于目标产品（基于单一或多种蛋白的 VLP）和生产策略（单一或合并感染）。对于基于单一蛋白的VLP，低 MOI（0.01-1）通常比高 MOI（>1 ）可获得更高的单位产量。
病毒Stock制备和VLP生产需要采用不同的MOI策略，病毒Stock制备通常采用较低的MOI，通过次级感染获得高质量毒种；而VLP生产中采用较高的MOI，通过提高宿主细胞重组表达和VLP组装动态的同步性，提高VLP产率。
2. CCI
理论上单位产率的差异可以通过 CCI 的增加来抵消，但是细胞密度效应会导致细胞特异性产率随着 CCI 的增加而降低。
3. TOH
BEVS/IC的重组表达和VLP产量高峰通常在感染后48-72小时，不同项目需要通过时间-产量曲线确定收获时间。
三、细胞培养基及细胞密度效应
如图2所示，细胞培养基对昆虫细胞生长和VLP产量具有很大影响，因此细胞培养基的筛选是BEVS/IC系统VLP生产上游工艺中的重要部分，筛选原则和流程与CHO细胞单抗系统类似，本文不做详细叙述。
图2. 细胞培养基及MOI对VLP表达的影响
细胞密度效应是制约通过瞬时转染和感染方式制备重组蛋白、病毒载体和VLP的常见问题之一，可以通过转染/感染前培养基更换，转染/感染后营养物质的添加等方式加以改善。
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参考文献：
1. https://www.theatlantic.com/health/archive/2021/06/novavax-now-best-covid-19-vaccine/619276/
2. Large-scale production and purification of VLP-based vaccines；Journal of Invertebrate Pathology，Volume 107, Supplement, July 2011, Pages S42-S48
3. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system；Lai et al. Journal of Biological Engineering (2019) 13:78
4. Keech, C. et al. Phase 1-2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant spike protein nanoparticle vaccine. N. Engl. J. Med. 383, 2320–2332 (2020).
5. Virus-like particles: preparation, immunogenicity and their roles as nanovaccines and drug nanocarriers; Journal of Nanobiotechnology volume 19, Article number: 59 (2021)