慢病毒包装技术详解
慢病毒载体（Lentiviral vectors,LVs）是在人免疫缺陷病毒（HIV-1病毒）基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体基因组是单股正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的基因或片段。
图1慢病毒LV的包装示意图。（图片来源于InvivoGen）
慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，其目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比（如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体），有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。
慢病毒表达载体删除了HIV病毒绝大多数基因，仅保留了HIV病毒的LTR序列，包装信号，Rev应答原件等。因此免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
慢病毒包装系统
慢病毒包装系统主要有慢病毒表达载体和包装载体及胞膜载体构成，一般由三个（二代系统）或者四个质粒（三代系统）构成，包装病毒所用细胞一般为293系列的细胞，其主要过程是将组成慢病毒系统的质粒共转染293细胞，48-72h后收集细胞培养基上清，经过浓缩纯化后的到慢病毒粒子。
案例展示
一、慢病毒载体在神经科学领域的应用
1.慢病毒搭载shRNA感染神经元
慢病毒载体搭载的Dyrk1α段发卡RNA（shRNA）干扰新生小鼠皮层的发育和神经元的迁移。（Dang,T,et al.Molecular Psychiatry.2017）
慢病毒搭载shRNA后干扰小鼠杏仁核内Akap5的表达，下调小鼠脑内BLA中Akap5的含量，可有效缓解小鼠出现慢性束缚造成的焦虑/抑郁样行为。(Zhou et al., Biol Psychiatry. 2019)
1.慢病毒标记CNS细胞
不同包膜的慢病毒载体携带特异启动子标记特定细胞类群。（Parr-Brownlie, Louise C. , et al. Frontiers in Molecular Neuroscience, 2015）
神经科学领域常用启动子
2.钙成像
Lenti-ER-GCaMP6超敏内质网ER Ca2+指示剂，清楚显示了胞体延申至树突及整个轴突网络。（De Juan-Sanz J , Holt G T , Schreiter E R , et al. Neuron, 2017.）
3.慢病毒（LV）结合狂犬病毒（RV）操控活性依赖的神经元
Lenti-hSyn-Cre用EnvA蛋白包装，获得CANE-LV-Cre选择性感染Fos+神经元。（Sakurai K , Zhao S , Takatoh J , et al. Neuron, 2016）
4.慢病毒介导基因沉默研究中间神经元电偶联
诱导型慢病毒shRNA有效介导Conne-xin 36敲减。将病毒注射到新生P1小鼠的硬脑膜和皮质层的间隙（e.f），P15小鼠中观察到GFP+主要分布在L1，在深层的分布较少。（Yao X H , Wang M , He X N , et al., Nature Communications, 2016）
5.慢病毒在光遗传学中的应用
慢病毒表达光敏感离子通道蛋白（ChR2）的神经元经蓝光刺激后细胞行为的改变。（LC Parr-Brownlie et al., Front. Mol.Neurosci，2015）
6.慢病毒的药理学应用
LV-hM3Dq研究PV中间神经元。DREADDr e c e p t o r h M 3 D q 在PV（Parvalbumin，Green）阳性中间神经元内表达。在小鼠海马注射 LVhEF1α-DIO-hM3D-GqmCherry，两周后在脑片中观察到海马hM3D-Gq(Red) 和PV (Green)的表达。( Zou et al. Curr MolMed. 2016)
二、慢病毒载体在其他领域的应用
1. 慢病毒CRISPR成像
LV-dCas9 和LV-sgRNA用于哺乳动物细胞基因组位点成像。(Baohui Chen et al., Cell, 2013)
1. 慢病毒介导的造血干细胞治疗X连锁严重免疫缺陷疾病（SCID-X1）
接受SIN-LV治疗后，SCID-X1病人T细胞和B细胞的功能改善。密码子优化的 Self-inactivating element LV，即SIN-LV（Cl20-i4-Ef1a-hγcOPT） 转导CD34+ HSC后回输给病人。上图显示病人的CD3T 细胞能够响应药物刺激增殖（A），治疗后的12-16周，病人出现 T1B cells（CD10++CD21lo）向T2/3 B cells+hi (CD10++CD21lo）的转变，免疫细胞类群构成多样性增加。(De Ravin et al.,Sci Transl Med, 2016)
1.LV-CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1
设计针对HIV LTR的gRNA序列(Top)，LV介导Cas9/gRNA投递抑制人T细胞感染HIV（Bott-om）。（Rafal Kaminski et al.,Sci Rep,2016）
1. LV-CRISPRa/i介导转录激活和抑制
LV-CRISPRi/a研究基因剂量控制基因功能。（Luke A. Gilbert etal., Cell, 2014）
参考文献
1. Dang T, Duan W Y, Yu B, et al. Autism-associated Dyrk1a truncation mutants impair neuronal dendritic and spine growth and interfere with postnatal cortical development[J]. Molecular Psychiatry, 2017.
2. Cetin, A. and E.M. Callaway, Optical control of retrogradely infected neurons using drug-regulated "TLoop" lentiviral vectors. J Neurophysiol, 2014. 111(10): p. 2150-9.
3. Wei, Y., et al., Lentiviral vectors enveloped with rabies virus glycoprotein can be used as a novel retrograde tracer to assess nerve recovery in rat sciatic nerve injury models. Cell Tissue Res, 2014. 355(2): p. 255-66.
4. Parr-Brownlie, L.C., et al., Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci, 2015. 8: p. 14.
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7. Sakurai K , Zhao S , Takatoh J , et al. Capturing and Manipulating Activated Neuronal Ensembles with CANE Delineates a Hypothalamic Social-Fear Circuit[J]. Neuron, 2016:S0896627316307164.
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14. Zhou, H. Y., J. G. He, Z. L. Hu, S. G. Xue, J. F. Xu, Q. Q. Cui, S. Q. Gao, B. Zhou, P. F. Wu, L. H. Long, F. Wang and J. G. Chen 2019. A-Kinase Anchoring Protein 150 and Protein Kinase A Complex in the Basolateral Amygdala Contributes to Depressive-like Behaviors Induced by Chronic Restraint Stress. Biol Psychiatry 86: 131-142. doi: 10.1016/j.biopsych.2019.03.967