科研 | Cell Metab.: 通过静磁场和电场来治疗2型糖尿病
编译：张娜，编辑：小白、江舜尧。
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氧化还原异常是许多慢性代谢性疾病的病理生理基础，其中就包括2型糖尿病(T2D)。本研究旨在通过一种非侵入性的、持续的方法，长期调控T2D的氧化还原信号。该研究表明，静磁场和电场(sBE)可以非侵入性地调节系统（还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）氧化还原，以促进氧化还原稳态。并且，在T2D小鼠模型中，sBE在短短3天内迅速改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐量异常，且无不良反应。用超氧化物歧化酶2（SOD2）清除肝脏线粒体氧代谢的顺磁副产物可完全消除胰岛素的增敏作用。该研究利用内源性电磁受体机制，非侵入性治疗T2D，并有望应用于其他与氧化还原相关的疾病。
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实验结果
1. 通过磁场和电场改善血糖
正常血糖的对照鼠和T2D、Bardet-Biedl综合征（BBS）、高脂饮食（HFD）以及db/db肥胖鼠模型在sBE中，持续30天（图1A）。结果表明，与对照组相比， sBE中BBS鼠的空腹血糖显著降低了43％，而HFD和db / db小鼠中的空腹血糖降低了33％，而后两个模型中的葡萄糖耐受不良均得到逆转（图1）。并且，单处于静磁场会加剧血糖升高，只有联合使用sBE才能显著改善葡萄糖耐量。接下来，作者研究了sBE是否通过提高胰岛素水平来发挥作用。结果表明sBE通过增强胰岛素敏感性发挥降血糖作用，而不是通过促进胰岛素分泌。值得注意的是，与连续暴露的小鼠相比，每天暴露7 h的小鼠显示出相似的葡萄糖耐量改善，表明不需要连续暴露即可达到治疗效果（图1G）。
2. sBE可增强胰岛素敏感性并改善胰岛素抵抗
为了明确sBE是否调节胰岛素敏感性，研究人员将NCD和HFD小鼠暴露于sBE长达30天，然后禁食6小时。在固定期间，暴露于sBE 30天的小鼠需要显着增加NCD中的葡萄糖输注率（GIR）和HFD小鼠中的输注速率，以维持正常血糖。连续暴露的3天内，胰岛素敏感性改善，而且每天暴露7 h同样有效（图2B）。在NCD鼠中，sBE暴露3天就可以将胰岛素的葡萄糖清除率提高14％，而HFD鼠提高62％（图2C、2D）。此外，NCD鼠中，sBE并不影响胰岛素抑制葡萄糖的产生，表明sBE主要通过胰岛素刺激葡萄糖清除引起GIR升高（图2E、2F）。
有趣的是，在NCD或HFD鼠中，sBE暴露均未增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取（图3A、3B）,但是无论是NCD还是HFD鼠，暴露于sBE都会显著增强葡萄糖整合到肝脏的糖原中，而不是骨骼肌中（图3C、3D）。并且单独sB或者sE暴露不会引起肝糖原的显着升高（图3E）,sBE暴露也可促进db/db鼠和人类原代肝细胞中肝糖原升高。这些数据表明，sBE暴露可显着增强胰岛素敏感性，并且肝脏可能是主要靶标。
图3 sBE可增强葡萄糖转化为肝糖原
（A）NCD鼠和（B）HFD鼠中14C-2-脱氧葡萄糖摄取到组织中。（C）NCD鼠和（D）HFD鼠中14C-2-脱氧葡萄糖转化为肝脏和肌肉糖原。（E）静磁场（sB），静电场（sE）或静磁场和电场（sBE）暴露25天后，HFD鼠的总肝糖原水平。（F）sBE暴露30天，db/db鼠的总肝糖原水平。（G）sBE暴露6小时后，原代人肝细胞的糖原水平。
3. sBE不会增强胰岛素信号传导中间产物的磷酸化水平
胰岛素或溶剂(PBS)静脉注射15分钟后，研究人员评估了暴露于sBE 3天的NCD和HFD鼠的胰岛素信号传导。胰岛素刺激增强胰岛素的信号传导，可通过调节葡萄糖稳态的三个关键组织中的蛋白质磷酸化来测量：肝脏，白色脂肪组织（WAT）和骨骼肌。结果发现，尽管sBE暴露增强了胰岛素敏感性，但与未经处理的小鼠相比，sBE暴露并没有增强肝脏、WAT或骨骼肌中AKT和GSK3b的磷酸化，这表明存在一种不涉及胰岛素信号中间产物磷酸化的胰岛素增敏机制。
4. sBE暴露不会发生不良反应
随后，研究人员将小鼠连续暴露于sBE至少30天，观察是否有不良反应的发生。结果表明未观察到异常的组织病理变化，血压无异常，超声心动图显示小鼠心功能正常。暴露于sBE的小鼠的葡萄糖排泄率不高。NCD和db/db鼠在体重、食物摄入量或能量消耗方面也没有变化(图3)。然而，HFD鼠表现出体重减轻，能量消耗和食物摄入量增加，这表明不同类型的小鼠存在差异。根据观察到的sBE暴露对肝脏葡萄糖代谢的影响，评估了肝线粒体的超微结构，显示线粒体形态正常。
5. sBE可降低氧化应激并激活NRF2
鉴于胰岛素信号的变化不能解释sBE对胰岛素的增敏作用，研究人员重点关注其他可以调节胰岛素敏感性的途径。氧化还原失衡与胰岛素抵抗有关。为了确定sBE是否通过氧化还原依赖性机制发挥生物学作用，研究人员测量了循环中的F2-异前列腺素（F2-IsoPs），这是一种由活性氧（ROS）驱动的花生四烯酸氧化产物，作为脂质过氧化和氧化窘迫的临床指标。
将NCD和HFD鼠暴露于sBE 3天，然后禁食16 h和再进食4 h后，检测F2-IsoPs水平，以评估sBE对禁食和进食状态下全身氧化负荷的影响。结果表明HFD鼠F2-IsoPs水平较高，表明糖尿病状态下的全身性氧化损伤更严重。相对于未处理的小鼠，NCD和HFD鼠的空腹状态下，sBE暴露使F2-IsoPs水平分别降低19％和20％；HFD小鼠的进食状态下，F2-IsoPs降低了37％（图4）。为了确定这些氧化负荷的显着变化是否与适应性氧化还原反应有关，研究人员观察了细胞氧化还原稳态的主要调节子核因子红系2相关因子（NRF2）的表达。激活该转录因子后，NRF2易位至细胞核，调节抗氧化反应元件的表达以启动氧化还原反应。将HFD小鼠暴露于sBE三天后，肝脏中的核NRF2水平显着升高（图4）。这些发现表明，暴露于sBE可激活糖尿病鼠的适应性氧化还原反应。
6．sBE可降低胰岛素敏感性的系统氧化还原反应
系统氧化还原环境由快速反应的抗氧化系统调节，谷胱甘肽-谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）和半胱氨酸-胱氨酸（Cys/CySS）是哺乳动物两个主要的抗氧化系统。GSH/GSSG系统和Cys/CySS系统几乎存在于每个细胞，并且是高度分隔的，包括细胞外区域，例如血浆。此外，硫醇介导的半胱氨酸修饰是另一种信号传导机制，可独立于蛋白磷酸化来调节蛋白质功能。研究人员研究了sBE暴露是否会引起这些关键氧化还原物变化。结果表明，与未暴露的糖尿病模型鼠相比，sBE暴露3天可使循环GSH升高了2.4倍，还原能力降低了25 mV。有趣的是，更普遍存在的氧化还原物Cys/CySS没有发生变化，表明GSH/GSSG氧化还原物有特定的全身作用。
此外，sBE暴露3天后，HFD鼠的循环蛋白S-谷胱甘肽酰化（PrSSG）和S-半胱氨酰化（PrCySS）分别降低60％和65％（图4E）。sBE暴露3天时肝脏GSH含量较高，而暴露30天时肝脏中GSH含量显着升高。这些结果表明，sBE暴露会改变肝脏的氧化还原环境，并且肝脏是sBE驱动的系统氧化还原环境变化的来源。
在正常血糖和高胰岛素血症抑制条件下，将氧化还原调节后的GSH/GSSG溶液输注到HFD鼠体内约1小时，体内GSH/GSSG的氧化还原潜力进一步降低（图4G）。值得注意的是，与sBE相似，在1小时内注入更具还原性的氧化还原物可模仿sBE暴露引起的胰岛素增敏作用（图4H）。相反，通过注入 GSH/GSSG 调节的溶液，逆转sBE引起的循环氧化还原稳态变化，以达到一个更加氧化的氧化还原环境，减弱sBE对胰岛素作用的影响（图4I）。这些数据表明，系统性氧化还原环境可快速控制胰岛素反应，并表明sBE暴露可通过减弱系统性氧化还原发挥胰岛素增敏作用。
7. sBE可改变活性氧稳态
硫醇抗氧化剂可以被过量氧化剂（包括活性氧）激活。长期以来，人们认为活性氧在胰岛素抵抗的发病机制中发挥重要作用，但其具体机制尚不清楚。鉴于许多活性氧具有自由电子，例如氧自由基（.O2−），它们具有顺磁性并参与T2D的病理生理，研究人员研究sBE暴露是否会改变.O2−的动态平衡。结果表明，当暴露于3.0mT的sBE时，Hepa1-6肝细胞中二氢乙锭（DHE）和MitoSOX的氧化作用明显低于未处理的肝细胞，这表明胞浆和线粒体.O2−的稳态水平较低(图5A)。此外，Amplex Red作为H2O2的稳态指示剂，sBE可增强Amplex Red的氧化作用。随后，研究人员利用高脂血症小鼠模型评估了sBE对体内.O2−标志物的影响。体内和体外成像显示，sBE暴露3天时可降低肝脏中DHE的氧化，但不降低肾脏或心脏中DHE的氧化，这与体外结果一致(图5B和5C)。但超氧化物歧化酶(SOD1和SOD2)或过氧化氢酶的活性或表达没有变化(图5D-5F)。这些数据表明，sBE可引起肝脏.O2−代谢的非酶性改变。
图5 sBE对肝内ROS的影响
(A)3.0mTsBE暴露，Hepa1-6细胞中二氢乙锭(DHE)、MitoSox(MITO)和Amplex Red(Amplex)的平均荧光强度(MFI)。(B)sBE暴露的HFD鼠体内DHE氧化图像(左)及MFI定量(右)。(C)sBE暴露3天的HFD鼠肝脏切片，DHE染色（左），及MFI定量(右)。(D-F) sBE暴露3天的HFD鼠，ROS相关的肝酶功能和表达水平。
8. 肝脏线粒体ROS介导sBE的胰岛素增敏作用
为了检测.O2−的参与程度，研究人员研究超氧化物歧化酶（SOD）对HFD鼠血清中.O2−的清除作用。GC4403是一种锰(II)五氮杂大环化合物，可以自由跨过细胞膜，对超氧化物高度特异。TEMPOL是一种膜透性抗氧化剂，多项研究表明可以清除.O2−。该研究发现，这两种超氧化物清除剂均能能完全减弱sBE的胰岛素增敏作用（图6A和6B）。
为了研究线粒体ROS的特异性，研究人员利用嗜肝腺相关病毒载体(AAV2/8血清型)与肝特异性嵌合启动子α1-抗胰蛋白酶增强子融合，在HFD鼠体内高表达人SOD2。结果表明肝脏中SOD2过表达可完全消除sBE的胰岛素增敏作用。
讨论
在弱静磁场和静电场的作用下，地球上的生命演化了数十亿年。然而，其中的生物学效应还没有得到很好的解释。在本研究中，研究人员证实了联合静磁场和静电场可通过氧化还原依赖机制发挥显著的胰岛素增敏作用。每天暴露sBE 7小时，在暴露3天后即可起作用，并且没有不良反应的发生。研究人员还发现，sBE对糖原合成可产生快速而强有力的影响，同时具有促进肝糖生成的效果。sBE具有胰岛素增敏作用，至少部分是通过调节全身GSH/GSSG 氧化还原而发挥作用的。暴露3天可导致血浆谷胱甘肽水平显著升高，全身氧化还原大大降低。此外，系统输注氧化还原调节溶液会迅速改变胰岛素的敏感性。这些发现与先前的研究结论一致，即细胞外氧化还原可调节胰岛素的敏感性和糖原合成。
在输注氧化还原调节剂后，sBE可快速调节胰岛素的敏感性。因此，快速的非遗传机制，如氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰（PTMs），可能参与调节胰岛素敏感性的蛋白功能。相对于Cys/CySS，受影响的主要氧化还原偶联物是 GSH/GSSG，因此GSH可能是敏感性的主要靶点。
当活性氧平衡紊乱时，硫醇氧化还原剂常用来维持氧化还原稳态。改变ROS内稳态，特别是超氧阴离子，可作为一个关键的启动信号，通过激活线粒体的仿生反应（mito-hormesis），从而提高抗氧化能力，发挥保护作用。该研究发现sBE暴露可改变肝脏线粒体活性氧的水平，增加肝脏NRF2的活化(NRF2水平的增加)，提高GSH/GSSG的抗氧化能力，并改善氧化应激(循环中异前列腺素的减少)。已有研究表明，激活mito-hormesis和诱导抗氧化反应，特别是 GSH 氧化还原系统，有益于代谢和胰岛素敏感性。然而，ROS 与mito-hormesis反应之间的机制联系尚不明确。
活性氧在其反应性和分子靶点方面存在差异，因此，适度改变活性氧的化学计量结构可能会产生完全不同的生物学效应。该研究表明sBE暴露改变ROS内稳态与O2·-的新陈代谢改变有关。但是由于活性氧信号的多样性和高度特异性，目前还没有研究能证实是哪种特定类型的活性氧参与调节电磁场的影响。
基于前人的研究，研究人员假设.O2−发挥顺磁传感器的作用，引发或介导sBE的效应。这一假想通过清除.O2−进行了测试，在SBE暴露期间，系统地使用药理分子，并通过遗传方法使其进入肝脏。去除可疑的中介信号(即.O2−)和线粒体SOD2完全减弱了SBE的胰岛素增敏作用，这支持肝脏中的线粒体O2·-是一个介导了SBE的重要信号的结论。这些发现通过证明代谢表型(即胰岛素反应性)取决于顺磁自由基(即.O2−)，扩展了先前对EMFs在ROS中作用的理解。据我们所知，这是第一个完全减弱和调节电磁场诱导的生物效应的研究，这是通过清除线粒体.O2−和调节系统的氧化还原环境来实现的。因此，我们认为暴露于SBE改变了肝脏线粒体ROS的环境，这是一种生物信号，可以触发适应性全身氧化还原反应，即胰岛素增敏。还需要进一步的工作来阐明起作用的确切机制。
虽然我们已经证明.O2−是这些效应的关键介质，但由于目前的技术限制，sBE和顺磁ROS之间相互作用的物理机制还没有阐明。作者给出了两种假设。其一是由于依赖于物理上对电磁场做出反应的磁感受器的存在；例如，通道的打开或关闭。然而，本研究中使用的弱场可能不足以改变选通属性。第二个假设是自由基对机制(RPM)，该机制被认为是迁徙动物接受磁吸引的基础。这一假说表明，弱电磁场改变了自由基中间体的自旋状态，从而改变其反应产物和下游效应。与RPM一致，sBE暴露会改变反应产物，并可能改变.O2−的形成速度，从而改变氧化还原环境以增强胰岛素敏感性。除了证实O2·-的参与外，本研究还发现肝脏线粒体是sBE的靶点。可能是因为肝脏是新陈代谢的纽带，解毒酶和呼吸反应会产生.O2−。要充分阐明这些机制，还需要进一步的工作。
尽管有多种选择，但许多T2D患者治疗失败，使他们患心血管疾病和过早死亡的风险大大增加。为了解决这些问题，研究人员已经尝试开发简单的方法来调整血糖水平。然而，最近的方法没有针对潜在的氧化还原失衡，而需要使用外源转基因、铁磁性纳米颗粒或电敏细胞的植入，从而限制了它们的临床应用。本研究表明，sBE治疗可以完全自动化、非侵入性的通过与内源性顺磁分子(例如O2·-)的相互作用和自身调节恢复氧化还原稳态(例如GSH/GSSG)，从而改善胰岛素抵抗。总的来说，本研究发现静磁场和静电场的一种新型生理效应，可以用于T2D和其他氧化还原相关疾病的持续性、非侵入性治疗。