狗骨髓间质干细胞的复苏和培养

骨髓间充质干细胞是一种能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。因其具有强大的增殖能力和免疫调节功能,故被广泛应用于组织工程,细胞治疗和基因治疗。

取自比格犬的骨髓,用狗间质干细胞完全培养基贴壁培养,传代扩增至第二代冻存,每支含细胞1×106个。

狗骨髓间质干细胞的复苏和培养

1. 水浴锅37°C预热。

2. 准备好狗骨髓间质干细胞完全培养基,温浴到37°C。

3. 取15 mL离心管,加入9 mL的完全培养基。

4. 从液氮中取出冻存的骨髓间质干细胞,立即放入-80°C冰箱(目的是让进入冻存管

的液氮挥发)。

5. 在-80°C放置2~3 min后,取出冻存细胞,将冻存管迅速放入37°C温水中,快速晃

动使管中内含物尽快融化。仔细观察,待冻存管内含物完全融化后取出。

注意:

  • 尽可能避免水没过管帽,以减少污染的风险。

  • 要快速完成细胞复苏过程,融化过程时间过长,会造成复苏后的细胞活性较差。

6. 用70%~75%的酒精擦拭消毒冻存管口的外表面。

7. 在超净台中打开冻存管,用吸管将细胞冻存悬液转移至装有9 mL完全培养基的15mL离心管中。注意避免产生气泡。

8. 为了减少细胞损失,再往冻存管中加入1 mL完全培养基,稍微吹打,收集至离心

管中。

9. 将细胞悬液经250 ×g(对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm)离心5 min。

10. 离心后尽量去除上清液,加入1~2 mL的完全培养基(已预热到37°C),轻轻吹打

混匀细胞沉淀。

11. 将细胞全部接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养器皿中,加入足量的完全培

养基。轻轻摇晃细胞培养瓶使细胞均匀分布。

12. 在37°C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

13. 复苏后的第2天,给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基(已预热到37°C)。

14. 之后,每2天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%~90%的汇合度。

15. 当细胞达80%~90%的汇合度,进行消化传代。

注意:为避免反复温热培养基,如果在一次操作中无法用完整瓶培养基,建议分装到

适当的无菌容器中。换液时只取当天所需用量的培养基进行预热。

2021-05-17

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