科研 | Nature子刊：利用定向纤维可实现对肠道微生物组及其代谢的精准调控

编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

肠道微生物组不仅可以有益调节人类的健康，而且对家畜也有较大的影响。在此背景下，本研究定制了一种乙酰化半乳糖葡甘露聚糖（AcGGM）纤维，以匹配两种产丁酸盐的肠道共生菌（Roseburia和Faecalibacterium）独特的酶能力。通过解析355个宏基因组组装的基因组以及定量的宏蛋白质组，发现在喂食AcGGM的猪中，两个靶标群体均差异表达AcGGM特异性多糖利用位点（包括对其分解至关重要的新型甘露聚糖特异性酯酶）。该研究证明使用结构复杂的乙酰化膳食纤维可以构建特定的肠道结构，这种方法有可能对宿主健康产生更大的调节作用。

论文ID

原名：Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut

译名：利用定向纤维可实现对肠道微生物组及其代谢的精准调控

期刊：Nature Communications

IF：12.121

时间：2020.11

通讯作者：Phillip B. Pope & Bjørge Westereng

通讯作者单位：挪威生命科学大学

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Web results那不勒斯腓特烈二世大学

实验设计

将48头28日龄的杂交断奶仔猪（长白×约克夏），雌雄各24头，平均初始体重（BW）9.8±0.5 kg，按窝、性别、体重进行排序，随机分为4头12个栏。仔猪饲喂含AcGGM日粮水平递增（1、2、4%）的以谷物为基础的日粮。

为评价生长性能，在开始时和每周一次记录每头猪的体重。实验期间记录每头猪的摄食量，计算个体增重和摄食量。通过热水提取和乙酰化得到结构复杂的AcGGM纤维。

在第0天和第28天采集小肠样本，用于测定肠道形态和完整性。采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的食糜样本进行SCFA分析。对所有粪便和肠道样本进行16S扩增子测序及宏基因组测序，结肠食糜进行宏蛋白组学检测。通过多组学的分析及验证探讨定向纤维对肠道微生物组及其代谢的精准调控作用和机理。

主要内容

1 用木材生产高度复杂的膳食甘露聚糖纤维

通过乙酰化对甘露糖残基进行大量酯化（图1a）。通过SE以及超滤和纳滤，最终所得产物纯度高、同时不会损害AcGGM纤维的复杂性（图1b、c）。采用SE共处理700 kg干燥的挪威云杉片，生产了50 kg用于饲料生产的寡糖/多糖（图1c–e），单糖（Man:Glc:Gal）比为4:1:0.6。乙酰化后，AcGGM纤维的聚合度（DP）显著上升，均表现出较高的乙酰化程度。其乙酰化模式与人类肠道Roseburia和Faecalibacterium spp中编码的甘露聚糖PULs的酶能力相匹配。因此，推测该AcGGM纤维极大程度上将与猪肠道生态系统中相同种群的代表相匹配（图1f）。

图1 挪威云杉AcGGM生产示意图。a研磨木屑用热水提取甘露寡糖。b水热预处理过程中，乙酸的释放促进了糖苷键的水解，从而去除了单糖、寡糖、和其他分解产物。c超滤精炼复杂寡糖。d将纯化的甘露聚糖以不同的水平掺入饲料颗粒。e生长性能实验和饲喂试验。f多组学方法用于分析猪肠道微生物组对AcGGM的反应。

2 AcGGM改变了断奶仔猪的肠道微生物组

对盲肠和结肠中短链脂肪酸（SCFAs）的测量显示，随着AcGGM水平的增加，绝对和相对丁酸水平有增加的趋势（图2）。此外，AcGGM可引起SCFA和微生物组组成的变化（图2和图3），且未观察到对宿主生理产生不利影响。

图2 在饲喂4种不同水平AcGGM日粮（0-4%）的猪盲肠和结肠食糜丁酸盐浓度变化。a丁酸的绝对水平。b丁酸的相对水平。

正如预期，AcGGM效应在肠道的纤维发酵远端区域（盲肠、结肠）更明显，观察到数百个系统发育型的相对丰度随不同的AcGGM水平而变化（图3a）。Faecalibacterium属所属系统发育型的16S rRNA基因相对丰度随着AcGGM水平的增加而增加（图3c），而Roseburia所属系统发育型似乎减少（图3b）。然而，对Roseburia附属MAGs的详细分析显示，编码AcGGM特异性PULs的特定系统发育型确实受到AcGGM纤维的刺激（图3b）。隶属于Prevotella 9属的纤维发酵群体也表现出不同的反应（图3g）。16S rRNA基因OTU和MAGs的相对丰度分析表明，属于非纤维降解分类群的系统发育型，如Catenibacterium、Dialister和Megasphaera，在对AcGGM的反应中表现出一些最高的剂量依赖性相对丰度增加（图3d–f），表明除纤维降解外，其他潜在因素可能也决定微生物组结构。

图3 含AcGGM日粮对猪肠道微生物组的影响。a饲喂不同AcGGM水平饲料的猪微生物群落之间Bray-Curtis距离的排序图。b从喂食不同水平AcGGM饲料的猪采集的盲肠或结肠样本中，Roseburia属的相对16S rRNA基因丰度。纳入AcGGM可提高Faecalibacterium属（c）、Catenibacterium属（d）、Dialister属（e）、Megasphaera属（f）和Prevotella 9属（g）的16S rRNA基因相对丰度。

3 在AcGGM饲喂猪的结肠中检测到靶向甘露聚糖PULs

为了检测产丁酸菌是否在AcGGM作用下被激活，注释了隶属于产丁酸菌的MAGs，并使用无标记定量（LFQ）对随机选择的4头对照猪和4头4% AcGGM喂食猪的结肠样本进行了宏蛋白质组学分析。并将8515个检测到的蛋白质组映射回MAGs以识别功能活性群体。蛋白质聚类分析表明AcGGM可改变仔猪的微生物群（图4a、b）。在喂食AcGGM的猪中，观察到Roseburia附属MAGs水平较低（图3b），检测到的蛋白的相对丰度也较低（图4c），这表明AcGGM对Roseburia种群产生了负面影响（图3b）。然而，检测到一个特定的Roseburia附属群体（MAG041）的丰度水平显著升高（图3b），与对照相比，其检测到的蛋白质在4% AcGGM猪样本中也显著富集（图4b、c）。

对MAG041检查发现其含有甘露聚糖降解PUL的CE2/ce17，而在其他Roseburia附属的MAGs中缺失，并在AcGGM饮食中差异表达（图5）。而且，MAG041甘露聚糖PUL与R. intestinalis strain L1-82 PUL表现出基因相似程度较高（图5）。因此可以假定两者可发挥相同的功能——分解AcGGM纤维。与Roseburia附属的MAGs相比，只有一个MAG与F.prausnitzii聚集（MAG243，图4）。与MAG041相似，发现MAG243编码含CE2/ce17的甘露聚糖PUL，存在AcGGM时可广泛检测到，但在对照样本中不存在（图5）。虽然MAG243甘露聚糖PUL含有两种GH130甘露寡聚磷酸化酶、一种甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸葡萄糖变位酶和两种碳水化合物酯酶（CE17和CE2），但它缺乏GH26甘露聚糖酶，这表明F. prausnitzii很可能优先分解AcGGM结构中较短的乙酰化甘露寡糖。除了在喂食AcGGM的猪中激活MAG041和MAG243的甘露聚糖PULs外，根据检测蛋白的无标记定量（LFQ）评分，还检测到其丁酸途径高水平富集（图6、7），表明两个群体均可将甘露聚糖转化为丁酸盐。

图4 从喂食对照4%AcGGM饲料的猪中采集的结肠样本的基因组中心元蛋白质组学分析。a两组的主成分分析。b检测到的蛋白质组丰度谱的分层聚类和热图。c从断奶仔猪结肠取样的355个MAGs的系统发育和元蛋白质组学检测。

4 特异性去除乙酰化是利用AcGGM的关键

利用甘露聚糖作为能源的一个关键步骤是2-O-、3-O-和6-O-甘露糖残基的去乙酰化。在R. intestinalis L1-82中，AcGGM去乙酰化通过两种碳水化合物酯酶（RiCE2和RiCE17）的协同作用发生，发挥互补特异性。

MAG041和MAG243均在其甘露聚糖PULs内编码CE2同源物，与RiCE2的同源性分别为63%和31%，已证实对3-O-、（4-O-）和6-Oacetylations具有活性，并且具有甘露聚糖特异性。对于CE17，MAG041和MAG243同系物与RiCE17的同源性分别为65%和46%，包括活性位点残基和芳香族堆积色氨酸，RiCE17与2-O-乙酰化特异性相关。在喂食AcGGM饲料的猪中，MAG041和MAG243CE的差异蛋白质组检测（图5）表明这两个群体均可适应AcGGM纤维的独特特征，并积极参与其在体内的利用。

图5 在喂食对照或4%AcGGM饲料的猪中，Roseburia-（MAG041）和Faecalibacterium-（MAG243）附属MAGs中编码的含CE2/CE17甘露聚糖PULs的元蛋白质组学检测。

5 AcGGM对非目标群体也会产生影响

尽管AcGGM纤维的特异性与目标种群的特定机制特征相匹配，但数据显示也有例外（图6）。发现与MAG041密切相关的特定群体在4% AcGGM存在的情况下要么不受影响（MAG292），要么被代谢抑制（MAG133）。这表明在大多数情况下，产丁酸盐群体似乎利用了淀粉、阿拉伯木聚糖和/或阿拉伯半乳糖纤维降解产生的糖，而非由AcGGM降解产生。

图6 饲喂AcGGM的猪结肠微生物组中丁酸盐产生菌的不同代谢。

除了产丁酸菌外，宏蛋白质组学富集分析显示，降解纤维的原生群体由于AcGGM的存在而产生了截然不同的效果。例如，MAG191检测到的蛋白质水平最高，这些蛋白质在4% AcGGM存在下以不同的方式富集在检测到的聚类中。富含AcGGM的Prevotella菌（如MAG191、MAG196、MAG285）的代谢通路注释表明，对饮食纤维如阿拉伯木聚糖、淀粉、葡聚糖、α-半乳聚糖和甘露糖以及乙酸盐、琥珀酸盐和/或丙酸盐代谢增强，在AcGGM饲养的猪中均检测到较高的LFQ评分（图7）。在Prevotella属的MAGs中发现了几种甘露聚糖靶向的PULs，其结合了外膜转运和碳水化合物结合SusC/D样蛋白以及CAZymes。此外，通过检测到的GH36和GH130推测MAG196和MAG191也许能够代谢AcGGM纤维的元件，如α-半乳糖侧链或去乙酰化甘露寡糖（图7）。饮食中包含AcGGM也导致了许多表型和系统发育上不同的微生物群体中明显的代谢转变，这些微生物群体通常与纤维水解无关。分析表明，尽管没有发现编码含CE2/ce17的甘露聚糖PULs，但隶属于Dialister（MAG150）、Catenibacterium（MAG048）和Megasphaera（MAG053）属的MAGs是AcGGM处理后三个差异表达最富集的群体（图7）。其中，MAG048蛋白质组包括一个糖磷酸转移酶系统（PTS）和GH1磷酸-β葡萄糖苷酶，这些酶可能催化二糖（如纤维二糖和甘露糖）的磷酸化，并将PTS转运的糖水解为D-葡萄糖和D-葡萄糖-6-磷酸。同时，在喂食AcGGM的猪中也高度检测到MAG048的糖酵解和乙酰化途径（图7）。

总之，这些数据表明，某些Catenibacterium种群正在有利地消耗AcGGM衍生的二糖，这些二糖可能是原始AcGGM纤维制剂的一部分，或是通过其他纤维降解种群的作用产生的。通过多组学方法预测MAG053和MAG150代谢SCFA，如乳酸盐和琥珀酸盐，其由MAG013和MAG285附属群体内源性生成，并分别产生丁酸盐和丙酸盐（图7）。总的来说，尽管高度定制的MDF可以直接激活内源性微生物组中配备酶的群体，但它们也可以无意中改变其他非甘露聚糖分解群体的代谢。

图7 根据基因组和蛋白质组比较推断，AcGGM饮食干预后猪结肠微生物组的代谢特征。

结论

本研究通过将表征的AcGGM纤维的结构特征与靶微生物群中的特定基因位点匹配，展示了纤维和微生物之间的关系可以用来直接靶向高度复杂的肠道生态系统中的特定微生物群。使用多组学分析，表明了AcGGM结构构型对猪消化道远端区域内微生物摄取和代谢的影响，AcGGM选择性的关键驱动因素是甘露聚糖乙酰化的存在，以及碳水化合物组成和大小。结构复杂的AcGGM导致断奶仔猪结肠微生物组组成发生高度特异性变化，丁酸：醋酸盐相对比值增加。此外发现AcGGM纤维在体内激活了特定Roseburia和Faecalibacterium种群的代谢反应，两个群体均表达来自CE2/ce17（含甘露聚糖PULs）的蛋白，与R. intestinalis L1-82中生化表征的代表同源。

综上所述，本研究数据为设计和匹配定制膳食纤维与其靶生物独特的酶特征的调节策略提供了基础。也强调了一个事实，即肠道微生物组固有的更大的相互联系的代谢交换和营养结构网络极易受到轻微的饮食干预。最终，需要进一步的研究来确定AcGGM MDFs是否可以在全规模畜牧业生产的背景下赋予动物性能指标（如生长和抗病性）的改善。

评述

本文通过从挪威云杉中提取加工得到乙酰化半乳葡甘露聚糖（AcGGM），通过对断奶仔猪进行饲喂，以此纤维靶向肠道远端产丁酸菌特有的甘露糖降解酶活性，并检测了多个肠道位点的多个组学研究，所得结果和技术方案对养殖业饲料开发及菌群的研究提供了新的见解。

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