科研 | SBB: 厌氧条件下的甲烷氧化可以显著减少稻田中甲烷的排放量（国人作品）
编译：葛体达，编辑：小菌菌、江舜尧。
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甲烷在厌氧条件下被氧化的现象（AnaerobicOxidation of Methane, AOM）在海洋生态系统中是普遍存在的，其甲烷的消耗量为20-300TgCH4 yr-1，占全球大气甲烷通量的60-80%，对全球甲烷平衡和气候变化有重要意义。海洋沉积物中AOM与SO42-的还原紧密相关。相比之下，AOM在陆地生态系统中的贡献及其发生机制仍不清楚。稻田是湿地生态系统中最重要的甲烷排放源之一，也是AOM发生的热点场所。同时，稻田受到高强度的田间管理干扰，使其土壤物理化学生物特征与自然湿地存在显著差异。为了探究稻田土壤中的AOM发生机制，研究人员利用同位素示踪技术对不同施肥（对照，猪粪肥，生物炭和氮磷钾肥）的稻田土壤，添加不同电子接受体（Fe3+, NO3-,SO42-, 和 humic acids）进行厌氧培养。
本研究首次证明了有机电子接受体（humic acids）是仅次于NO3-作为AOM的重要驱动力，在稻田土壤中至关重要。据估计，全球稻田中依赖NO3-（NO2-）的AOM可消耗约3.9Tg C-CH4 yr-1，相当于10-20％的全球稻田甲烷排放量。因此，本研究强调了适当调整土壤施肥策略将有助于减少稻田向大气中排放的甲烷通量，从而有助于减缓全球变暖。
论文ID
原名：Anaerobic oxidation of methane in paddy soil: Role of electron acceptors and fertilization in mitigating CH4 fluxes
译名：稻田中甲烷的厌氧氧化特征：不同电子接受体和长期施肥在减缓甲烷排放中的作用
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2020.02
通讯作者：范利超&葛体达
作者单位：德国哥廷根大学&中国科学院亚热带农业生态研究所
实验设计
1 研究地点和土壤采样
实验供试土壤采自中国科学院长沙农业环境观测研究站的长期定位稻田。实验区属典型的亚热带季风气候，年降水量为1330 mm，年平均气温为17.5℃。该地区有超过一千年的水稻种植历史，土壤来源于第四纪红土被分类为Hydragric Anthrosol。本实验选取四种施肥包括对照，猪粪肥，生物炭和氮磷钾肥处理的土壤。每种施肥处理随机选取三个样方（35 m2），其中每个样方取4个采样点并采集土层为20-30 cm的土壤混合为一个土样。2016年12月土样于稻田排洪后采集并在一周内空运至德国哥廷根大学农业土壤系实验室4℃保存。
2 厌氧培养和添加电子接受体
称取15 g土壤于100 ml的广口瓶中，使用黑色橡胶瓶塞密封培养瓶，并通过蓝色塑料螺帽固定瓶塞。所有培养瓶和瓶塞在121℃灭菌20 min两次。在培养瓶转移至厌氧箱对土壤进一步处理之前，培养瓶中的空气通过真空泵抽吸5 min然后使用高纯N2对其置换，抽吸置换过程进行至少8次。为了保证培养瓶中的厌氧环境，把培养瓶放置过夜后转移至厌氧箱（N2/H2, 97/3%）中。在厌氧箱中，打开培养瓶添加20 ml去离子水（或者相应电子接受体的溶液，见下），使土壤形成泥浆状。另外，为了检测培养期间培养瓶的厌氧状态，在培养瓶中放置厌氧指示条（白色-厌氧，粉红色-有氧；Thermo Scientific, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK）。
本文实施了5种电子接受体处理：（1）对照（Reference），不添加；（2）Fe3+ (23.3 mg g-1)，以Fe2O3粉末形式添加；（3）NO3- (22.3 μg g-1)，以NaNO3溶液添加；（4）SO42- (12.7 mg g-1)，以Na2SO4溶液添加；（5）Humic acids (1.25 mg g-1)，以溶液形式添加，Humic acids购于Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany。每个培养设3个重复，实验设计见图1。
3 同位素标记和气体采集
为了量化AOM，5 ml 5 atom% 13CH4 注入到密封的培养瓶中，培养瓶中甲烷的浓度为3.1%。同时设置自然风度的培养瓶即5 ml N2代替甲烷。
在84天的厌氧培养中，在培养的第2, 7, 14, 21, 28, 42, 56和 84天采集气样。采气装置是由2个1 ml和1个2.5 ml的注射器通过三通阀连接在一起，采集的气体1 ml在真空管中稀释至15 ml用于甲烷和CO2浓度的测量（GC-14B, Shimadzu, Ld. Nds., Japan），另1 ml气样稀释至12 ml用于13C丰度的测量（Delta plus IRMS, Thermo Fisher Scientific, Bremen,Germany；德国哥廷根大学同位素分析中心）。采气后同时补充2 ml的N2用于平衡培养瓶中的气压。
4 计算和统计分析
CO2是甲烷厌氧氧化的最终产物，所以甲烷的氧化量是通过示踪13C在CO2的丰度增加，进而量化AOM。计算公式如下：
其中COX（μg）表示氧化的13CH4的量，CTotal表示相对应的C库总量（即CO2），δ13CTotal是13CH4处理的样品中13CO2的丰度增量值，δ13CControl 表示添加N2样品（自然丰度）处理的 13CO2的丰度增量值，δ13COX是5atom％的13CH4的丰度值（即3774‰）。通过ANOVA分析数据的显著差异，并使用LSD检测来比较不同处理间的均值。所有数据均基于Shapiro–Wilk进行正态分布检验。
结果
1 甲烷的浓度变化
在自然丰度条件下（图2，左栏），添加Humic acids使甲烷浓度增加了4.3~20.2倍。添加NO3-不会显著影响甲烷浓度。在氮磷钾肥处理下，添加Fe3+使甲烷浓度减低了2倍。添加SO42-后，所有施肥处理中的甲烷浓度降低了3.4~5.5倍除了猪粪肥处理。在13CH4处理条件下（图2，右栏），添加Humic acids 使甲烷浓度显著增加。添加Fe3+和NO3-使甲烷浓度增加但与Reference相同。添加SO42-后，甲烷浓度在培养期间无显著变化。
2 δ13CO2signatures
与自然丰度处理相比（图3），添加NO3-使13CO2丰度最大，其次是Reference和添加Fe3+（P <0.05）。这种趋势在猪粪肥处理中表现最为显著，其次是对照和氮磷钾肥，而在生物炭处理中最低。在所有施肥处理下，添加SO42-对13CO2丰度无显著的影响。添加Humic acids使13CO2丰度于培养的前期和后期均在对照，生物炭和氮磷钾肥处理下显著增加。
3 AOM速率
添加NO3-使AOM速率增加了20-90%，但其在生物炭处理下与对照无显著差异（图4）。AOM速率在猪粪肥处理下最大，其次是对照，氮磷钾肥和生物炭处理最低。添加Fe3+使AOM速率在对照和猪粪肥处理下显著降低，但生物炭和氮磷钾肥处理下的AOM速率无显著差异。添加SO42-使AOM速率显著降低了5-51倍，但生物炭处理与对照相同。Humic acids使AOM速率降低了25-256％。
4 AOM在培养期间的累积量
与AOM速率相似，累积AOM取决于不同的施肥处理和添加不同的电子接受体（图5）。甲烷的产生量与累积AOM之间存在显著的线性相关（图6）。
讨论
1 AOM速率和“reverse methanogenesis”假设
本文通过13C丰度的显著增加（图3）验证了稻田中AOM的发生。本研究首次描述了AOM如何取决于不同的土壤施肥类型和电子接受体（图7）。在相同的土层下，本研究的AOM速率与之前报道的稻田AOM速率相同。同时，本研究的AOM速率与湿地和热带矿质土壤的AOM速率相当。有趣的是，我们观测到的 AOM速率比泥炭地，淡水沉积物和海洋生态系统中低1-2个数量级。因此，AOM的发生强度在各种生态系统中存在很大差异性。
我们发现甲烷的产生量与累积AOM之间呈显著的线性相关（图6）。这表明甲烷的厌氧氧化过程与甲烷的生成过程紧密相关，称之为“reverse methanogenesis”机制。但在我们的结果中，不同的电子接受体的表现作用不一致。Humic acids显著地促进了甲烷的产生，但延迟了AOM反应（图5）。另外，SO42-只部分抑制了甲烷的生成（图2），而完全抑制了AOM过程（图5）。所以，甲烷的产生与AOM之间的明显“脱钩”现象表明“reverse methanogenesis”不是稻田AOM的唯一机制。
2 NO3-对AOM的作用
NO3-是稻田AOM最有效的电子接受体，因为添加NO3-显著促进了NO3-/ NO2-驱动的AOM。与其它电子接受体（例如SO42-）相比，NO3-在热力学上最有利于生成ATP，且NO3-驱动的AOM产生的吉布自由能比其他电子接受体的高1个数量级。Candidatus 'Methylomirabilis oxyfera’(M. oxyfera) 介导NO2-驱动的AOM，M. oxyfera通过在细胞内将NO2-还原和NO歧化作用产生一个氧原子，进而通过胞内有氧氧化途径将甲烷氧化。NO3-驱动的AOM通过厌氧甲烷营养型古菌Candidatus 'Methanoperedens nitroreducens’ (M.nitroreducens)进行，这些古菌利用NO3-作为末端电子受体，通过“reverse methanogenesis”途径独立进行AOM。该过程已经在淡水沉积物和厌氧废水污泥以及稻田中被检测到。
在不同施肥类型中，与其他有机/无机肥料和对照相比，猪粪肥处理稻田土壤具有最高的AOM速率（图4）。这可能由于猪粪肥的长期施用可以增加稻田土壤中NO3-的含量，且可以为AOM相关微生物提供更为合适的环境，进而提高了AOM速率。
3 SO42-对AOM的作用
SO42-还原和AOM的耦合作用已在海洋环境中得到了证实，是由ANME-1，ANME-2a，-2b和2c以及ANME-3与SO42-还原细菌共同完成。但是，目前SO42-对AOM的驱动作用在不同生态系统中的表现是截然不同的。在本研究中SO42-完全抑制了AOM的发生。这与Hu et al., (2014）的研究结果一致，后者报道在水稻土和湿地中添加SO42-并没有13CO2的积累。相反，Segarra et al., (2015) 发现SO42-还原率和AOM之间存在显著正相关性（r = 0.85，P <0.01）。另外，Gupta et al., (2013) 发现只有在高浓度的SO42-条件下，SO42-才能驱动AOM。同时，Gupta et al., (2013) 还观察到在有些样地中SO42-还原率和AOM之间存在显著的负相关。
4 Fe3+对AOM的作用
5 Humic acids对AOM的作用
在所有施肥处理下，Humic acids均显著促进了甲烷的生成。该结果与Blodau和Deppe（2012）的发现相反，后者报道了Humic acids强烈抑制了加拿大Mer Bleue沼泽泥炭中的甲烷排放。这些相互矛盾的结果表明，Humic acids在不同的环境中可能发挥着不同的作用，即在有机质含量相对较少的稻田土壤中，Humic acids可作为电子供给体并为甲烷生成提供底物（例如乙酸盐），进而促进了甲烷的排放，而在有机质含量相对丰富的泥炭地中它可作为电子接受体而促进甲烷的氧化。Humic acids可以促进AOM。但是与NO3-相比，我们发现了Humic acids对AOM 的促进作用有一个明显的延迟效应（图5）。这里有两种可能解释的原因：
（i）与NO3-不同，我们所添加的Humic acids不能直接作为AOM 的电子接受体，而必须经过分解其部分中间产物才能用作AOM的电子接收体。如果是这样，则AOM的速率将取决于Humic acids的分解速率。这种情况与Bai et al., (2019) 的发现一致，即AOM的最高速率出现在Humic acids添加后的第23天。另外，化合物anthraquinone-2,6-disulfonic acid andanthraquinone-2-sulfonic acid作为Humic acids分解的中间产物的人工替代物已被证实可以作为AOM的电子受体。
（ii）AOM由不同的微生物群落独立完成，但不同微生物群落对甲烷的亲和力不同。Raghoebarsing et al., (2006) 发现依赖SO42-的AOM对甲烷浓度的亲和力比依赖N O2-的AOM过程低4个数量级。在对照和生物炭处理的水稻土中添加Humic acids后，当甲烷浓度超过400 μg时AOM的累积量才显著增加。但是在猪粪肥处理下的土壤中，甲烷浓度在低于220 μg的情况下AOM的积累量也显著增加。这表明Humic acids可以促进低甲烷亲和力的甲烷氧化菌的活性。因此，在有机质含量较低的水稻土中或当甲烷浓度较高时，Humic acids可以作为 AOM的有效电子接受体。
6 减少甲烷排放的稻田施肥管理策略
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