细胞迁移/侵袭/划痕实验技术方法
具体方法
1 、划痕实验
细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后 继续培养细胞至实验设定的时间（例如 72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。
特点：
细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。与 transwell相比，细胞划痕实验具有经济、操作方便等优势。
材料：
6 孔板（其他的也可以，但感觉 6 孔比较好，大小适中）、 marker 笔直尺、 20 微升枪头（灭菌）、无血清培养基、 PBS
实验步骤：
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和 marker 笔在操作前紫外照射 30min （超净台内）
(1) 先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔 0.5-1cm 一道，横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。
(2) 在空中加入约 5X105 个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
(3) 第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
(4) 用 PBS 洗细胞 3 次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
(5) 放入 37℃ 5% CO2 培养箱，培养。按 0 ， 6 ， 12 ， 24 小时取样，拍照。
注意事项：
一般做划痕实验，都是在无血清或者底血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固定的问题。
2 、细胞迁移与侵袭实验
将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
材料准备：
可拍照显微镜， Transwell 小室，孔径 8μm ，没包被胶的 (Coster 和 Corning 公司的也较常用 ) ， Transwell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套， BD 公司的 Matrigel ，无血清 DMEM ， (1% 胎牛血清 )DMEM 和 1640培养基， DMEM 完全培养基， 1640 完全培养基（也可加到 20% 血清），无菌 PBS ，棉签，胰酶， 4% 多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（ 0.1% （ g/ml ） PBS 结晶紫）
实验步骤：
(1) 基质胶铺板：
用 BD 公司的 Matrigel 1 ： 8 （根据细胞产生 mmp 的量来决定）稀释，包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃30min 使Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
(2) 制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12 － 24h ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1 － 2 遍），用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 5×105/ml 。
(3) 接种细胞
① 取细胞悬液 100undefinedmicro;l 加入 Transwell 小室。
② 24 孔板下室一般加入 600undefinedmicro;l 含 20%PBS 的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③ 培养细胞：常规培养 12 － 48h （主要依癌细胞侵袭能力而定）。 24h 较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
(4) 结果统计
直接计数法， “ 贴壁 ” 细胞计数，这里所谓的 “ 贴壁 ” 是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。
取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，甲醇固定 30 分钟，将小室适当风干。
0.1% 结晶紫染色 20 min ，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS 洗 3 遍。 400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。