大鼠骨髓间充质干细胞分离操作方法

（1）取SD大鼠（2周龄），颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。

（3）从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。

（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。

（5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。

（6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

（7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。

（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

细胞形态

骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。