科研 | Nature子刊：CARD9，肠道菌群和色氨酸相互作用对结肠炎的影响
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人体胃肠道中的微生物群落是宿主健康和营养的基础。这个复杂的生态系统的失调涉及许多病症，包括IBD。IBD是遗传易感性，肠道微生物群的生态失调和环境因素共同影响的疾病。CARD9是众多IBD易感基因之一，其编码接头蛋白，整合模式识别受体下游的信号途径。CARD9通过激活IL-22途径促进结肠炎的恢复，Card9-/-小鼠更容易患结肠炎，并且肠道真菌的丰度增加。由于促炎微生物数量的增加，生态失调通常被视为肠道炎症的一个原因。然而，缺乏具有调节功能的微生物也可能增强炎症。
最近的研究表明，微生物群代谢色氨酸产生的代谢物以依赖于IL-22的方式，通过AHR在粘膜免疫应答中发挥作用。众所周知，IL-22是一种对肠内稳态发挥作用的细胞因子。本文评估了CARD9，微生物群和色氨酸在肠内稳态中的相互作用。
论文ID
原名：CARD9 impacts colitis by altering gut microbiota metabolism of tryptophan into aryl hydrocarbon receptor ligands
译名：CARD9改变肠道微生物群将色氨酸代谢成AHR配体的功能，进而影响结肠炎
期刊：Nat Med.
IF：32.621
发表时间：2017年
通信作者：Harry Sokol
通信作者单位：法国索邦大学
实验设计
实验设计流程图
实验内容
1、Card9-/-小鼠易患结肠炎
与WT小鼠相比，Card9-/-小鼠的上皮细胞增殖减少并且细胞凋亡增加，分别表现为增殖标志物Ki67的染色减少和切割的半胱天冬酶3 (caspase 3)的染色增加，证实了Card9-/-小鼠的肠道愈合受损（图1a，b）。在第7天和第12天，Card9-/-和WT小鼠之间差异表达最多的基因是Reg3g (编码REGIII-γ)，Reg3b（编码REGIII-β）和白细胞介素1β（Il1b）（ 图1c）。IL-22诱导肠上皮细胞表达抗菌蛋白，例如REGIII-γ和REGIII-β。此外，IL-17A与IL-22协同发挥保护作用。通过实时qPCR检测，第12天时，Card9-/-小鼠的Il22，Reg3g，Reg3b和Il17a在结肠的表达水平降低（图1d）。在结肠固有层中，在第0天和第12天，Card9-/-小鼠中IL-22+细胞的百分比降低（图1e）。在这些细胞中，CD3-CD4-NKp46-亚型在第12天减少（图1f和补充图3）。这些结果强调了CARD9及其效应物IL-22在缓解DSS诱导的结肠炎中的作用。那么微生物群在Card9-/-小鼠对结肠炎过度易感性中发挥了什么作用呢？
图 1
2、Card9-/-小鼠的肠道菌群发生变化
作者研究了在基线和结肠炎期间的真菌和细菌的组成变化（图2）。在Card9-/-和WT小鼠中，结肠真菌水平在第7天达到峰值，但在Card9-/-小鼠中更高（图2a）。Card9-/-小鼠中的真菌组成在第0,7和12天发生改变，而WT小鼠的结肠炎略微改变，WT小鼠对DSS诱导的结肠炎耐受性更强（图2b和补充图4a），并且多样性分析表明，在WT小鼠中，真菌的恢复能力高于Card9-/-小鼠（图2c）。WT和Card9-/-小鼠的真菌主要由子囊菌门，担子菌门和接合菌门组成（图2d和补充图4b）。LEfSe分析发现了Card9-/-和WT小鼠的基线粪便真菌组成的几个差异（图2h和补充图4b）。
此外，结肠炎期间，WT和Card9-/-小鼠的细菌组成的变化模式类似，但Card9-/-小鼠中的菌群稳定性降低（图2e，f和补充图4c，d）。在任何时间点，WT和Card9-/-小鼠之间的生物多样性未见明显差异（图2g）。LEfSe分析显示了基线处的差异，Card9-/-小鼠中的Adlercreutzia（属），Actinobacteria（门）和罗伊氏乳杆菌减少（图2h）。在WT小鼠中，细菌和真菌的生物多样性呈负相关的关系（图2i），提示了二者之间的跨种关系和可能的竞争关系。相反，在Card9-/-小鼠中呈正相关的关系，表明细菌和真菌在肠道生态系统内的异常相互作用，可能对肠内稳态产生影响（图2i）。总体而言，这些结果表明CARD9在塑造细菌和真菌肠道微生物群中起作用，并且是控制结肠炎中的真菌微生物群扩增所需要的。
图 2
3、Card9-/-小鼠的肠道菌群促进炎症
为了验证肠道微生物群的影响，我们用WT（WT→GF）或Card9-/-（Card9-/-→GF小鼠的微生物群移植给WT无菌（GF）小鼠，并对受体小鼠进行DSS处理。微生物群移植足以重现在Card9-/-小鼠中观察到的表型，如结肠炎易感性增加和恢复受损，上皮细胞增殖减少和细胞凋亡增加（图3a-d和补充图6a）。与WT→GF小鼠相比，Il22是Card9-/-→GF小鼠中下调幅度最大的基因之一（图3e）。类似的，在第0天和第12天，Card9-/-→GF小鼠中结肠中的Il22表达降低（图3f）。 此外，在第0天和第7天，与WT→GF小鼠相比，Card9-/-→GF小鼠中Reg3g和Reg3b的表达水平降低（图3f）。相比之下，Il17a的表达没有明显差异（图3f）。同时，结果发现，在基线，第7天和第12天，Card9-/-→GF小鼠的结肠和肠系膜淋巴结（MLN）中的IL-22蛋白质水平的低下（图3g，h），但是MLN或结肠中IL-17A，IL-6，IFN-γ或IL-10没有显著变化（图3g，h和补充图7b，c），表明IL-22信号通路在Card9-/-→GF小鼠中特异性受损。第12天，与WT→GF小鼠的结肠固有层相比，在Card9-/-→GF小鼠的结肠固有层中，TH22，NKp46+ ILC，LTi细胞和CD3-CD4-NKp46-细胞的IL-22产生减少（图3i和补充图8）。这些数据表明，Card9-/-小鼠的微生物群不能有效诱导结肠中T细胞和ILC产生IL-22，导致DSS诱导的结肠炎的恢复受损。
图 3
4、Card9-/-→GF小鼠的色氨酸代谢受损
色氨酸可通过肠道细菌代谢成吲哚衍生物，吲哚衍生物属于AHR配体，可以促进局部IL-22的产生。在GF小鼠中，IAA的产生受损，并且Kyn水平也低，可能是由于肠道免疫系统的发育不足（图4a和补充图11c，d）。最值得注意的是，Card9-/-→GF和Card9-/-小鼠的IAA水平降低，而结肠内的细菌含量不变（图4a和补充图11c-e），表明Card9-/-小鼠的微生物群变化导致低水平的IAA。采用AHR报告系统发现，Card9-/-和Card9-/-→GF小鼠的粪便不能有效激活AHR，与GF小鼠的粪便相似（图4b和补充图12b）。随后，用AHR的激动剂6-甲酰基吲哚（3,2-b）咔唑（Ficz）处理DSS诱导的结肠炎小鼠，结果发现：在恢复期间，与未治疗的对照组相比，用Ficz治疗的Card9-/-和Card9-/-→GF小鼠小鼠的结肠炎严重程度（体重减轻，组织学评分和结肠缩短）降低，与WT或WT→GF小鼠中观察到的严重性接近（图4c-e和补充图12c-e）。响应地，Ficz恢复了Card9-/-和Card9-/-→GF小鼠结肠的Il22，Reg3g和Reg3b表达（图4f和补充图12f）。结肠IL22的蛋白质水平也得到了恢复（图4g和补充图12g）。此外，从WT小鼠中分离的三种乳酸杆菌激活了Card9-/-→GF小鼠的AHR（图5a，b），缓解了Card9-/-→GF小鼠对结肠炎的易感性，及恢复了IL-22的表达和AHR配体产生（图5c-j）。三种乳酸杆菌发挥的作用由AHR介导，因为AHR拮抗剂消除了这种作用（图5e-j）。
图 4
图 5
5、IBD患者的AHR活性和色氨酸代谢受损
研究发现，健康受试者的粪便样品活化AHR的能力强于IBD患者的样品（图6a），原因之一是因为IBD患者的粪便样品中色氨酸和IAA水平降低以及Kyn水平升高有关（图6b和补充图15b-d）。对IBD患者中的CARD9（rs10781499）的IBD相关单核苷酸多态性（SNP）进行基因型鉴定，发现风险等位基因与粪便微生物群产生的代谢物降低了AHR活化相关（体外试验）（ 图6c和补充图15c，d）。这些结果表明了IBD，CARD9和微生物群产生AHR激动剂的能力之间存在联系。
图 6
结 论
本研究证明Card9缺失影响了小鼠的肠道微生物群，并且Card9-/-→GF的菌群移植足以重现Card9-/-的IL-22活化缺陷，并且受体小鼠对结肠炎的敏感性增加。这些改变是由于Card9-/-小鼠的微生物群将色氨酸分解代谢成AHR配体的能力受损。此外，通过补充产生AHR配体的乳杆菌，缓解了Card9-/-→GF小鼠的结肠炎恢复了AHR配体的产生，降低小鼠的易感性。因此，本研究表明，与先天免疫相关的因子（例如CARD9）的表达缺陷可以改变微生物群，进而改变宿主免疫应答。
评 论
本研究发现IBD患者中的微生物产生AHR配体的功能受损与CARD9内的IBD相关SNP相关（rs10781499）。因此，肠道微生物群分解色氨酸产生的代谢物可以作为生态失调的生物标志物，并且可以靶向用于IBD个体的新治疗药物的开发，例如，吲哚衍生物或者可以产生吲哚衍生物的益生菌。
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