重磅干货！荧光共定位的散点图解析！

上期推文中，我强调了荧光共定位定量分析的三大要点。

① 散点图

② 皮尔逊相关系数

③ 重叠系数（也称为共定位系数）

皮尔逊相关系数和重叠系数其实是Image Pro Plus根据散点图进行回归分析计算得到的。

因此，解读散点图成为重中之重，也是发表论文时必须报告出来的。

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▼ 1.为什么要分析散点图？

其实最开始定量分析共定位是采用划线法。

IPP把人为划定的线条上的红色通道、绿色通道强度值转换为波形图（如下）。

很快，大家注意到这条人为划定的线不靠谱，线段的位置和长短不同，右侧的波形肯定也会变化。这种局部测量波形图给造假者留下了空间。

于是，散点图出现了。

将整张图中所有荧光点纳入，分离为红色通道和绿色通道，然后根据两个通道的强度（也就是灰度）生成散点图，并计算相关系数。

这样就造不了假，只要图片不变，散点分布是无法被人为操纵。

▼ 2. 散点图有哪些信息？

（2.1）如果蛋白A（红色通道）和蛋白B（绿色通道）存在一定的共定位关系，那么散点图中的散点分布会呈现3种形态。

● 形态1：

总体呈棒槌状，基本线性分布，靠近Y轴（绿色通道）。

说明：蛋白A和蛋白B存在一定的共定位关系，但蛋白A荧光强度高于蛋白B。

● 形态2：

总体呈直棒形状，线性分布，对角分布。

说明：蛋白A和蛋白B存在很强的共定位关系，且蛋白A荧光强度与蛋白B基本相当。

● 形态3：

总体呈棒槌状，基本线性分布，靠近X轴（红色通道）。

说明：蛋白A和蛋白B存在一定的共定位关系，但蛋白B荧光强度高于蛋白A。

（2.2）如果蛋白A（红色通道）和蛋白B（绿色通道）的共定位关系很弱，那么散点图中的散点分布会呈现以下内凹形态，这。

（2.3）散点图中4代表的是共定位荧光图像中的背景荧光，该区域内散点越多，说明背景荧光越强，散点图中会呈现以下形态。