编译：艾奥里亚，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
许多变温动物在严酷的冬季条件下会采取冬眠策略，以提高它们的存活率。然而，这一过程背后的分子机制仍不清楚。本研究中，我们运用多组学分析方式对扬子鳄的冬眠机制进行了研究。我们发现：（1）冬眠期间甲状腺激素生物合成、营养吸收和代谢、肌肉收缩、尿液排泄和免疫功能途径全面下调；（2）脂肪分解代谢完全受到抑制，而与之形成鲜明对比的是，肝脏脂肪酸转运蛋白CPT1A的上调，这一结果表明了一种与冬眠哺乳动物不同的独特节能策略；（3）冬眠相关基因不仅受DNA甲基化的直接调控，还受甲基化依赖的转录调控。此外，我们鉴定和比较了组织特异性、物种特异性和基于季节性的保守miRNAs，显示了冬眠期间复杂的转录后调控。基于本研究结果，我们揭示了扬子鳄冬眠的遗传和表观遗传机制，为冬眠调节的进化提供了分子方面的见解。
原名：A Unique Energy-Saving Strategy during Hibernation Revealed by Multi-Omics Analysis in the Chinese Alligator
译名：多组学分析解释了扬子鳄冬眠过程中独特的节能策略
期刊：iScience
IF：5.965
发表时间：2020年6月26日
通讯作者：方盛国
通讯作者单位：浙江大学（Zhejiang University）
DOI号：10.1016/j.isci.2020.101202
扬子鳄组织（包括肝脏、脂肪、心肌、骨骼肌、脑、下丘脑、脾脏、肾脏、肺、小肠和甲状腺组织）由浙江长兴尹家边扬子鳄保护区（CCANR）提供。分别于2015年1月从两个成年冬眠个体（一雄一雌）采集冬季样本，于2015年5月从两个不同的成年个体（一雄一雌）采集夏季样本。所有样品收集经中国国家林业局和浙江大学动物伦理委员会许可进行。基于利用mRNA-seq、亚硫酸氢盐测序（BS-seq）、小RNA测序（sRNA-seq）和iTRAQ/TMT蛋白分析对其进行了分析，以全面探讨爬行动物冬眠的遗传和表观遗传机制。
图1 本研究中使用的扬子鳄组织样本。
1 冬眠期间能量代谢被抑制
为了深入探究扬子鳄在冬眠期间大幅节能的分子机制，我们对冬季和夏季收集的扬子鳄血清组织和蛋白质组的转录本进行了比较。转录组的季节性变化与不同组织的生物学功能相匹配。为了将其与BS-seq和sRNA-seq数据相关联，在随后的大多数分析中，我们将重点放在了雌性扬子鳄的转录本上。但我们在雄性和雌性动物的组织中发现两者之间的基因表达模式在很大程度上具有相似性。
1.1 甲状腺激素的生物合成和信号传导
下丘脑-垂体-甲状腺轴在新陈代谢调节方面具有至关重要的作用。我们的结果表明，在冬眠过程中，下丘脑的促甲状腺素释放激素基因（TRH）和甲状腺激素的生物合成途径均下调。KEGG途径分析表明，在下调的差异表达基因（DEGs）中，“甲状腺激素生物合成途径”在冬眠期间被富集（冬季抑制的DEGs）（q<0.05）。参与甲状腺激素生物合成的包括TSHR、TG和TPO在内的各种基因，在冬季受到抑制（图2A）。相应地，血清甲状腺激素（T3、T4、游离T3和游离T4）、TG抗体和TPO抗体水平在冬季显著降低。血清样本的iTRAQ/TMT分析表明，“甲状腺激素信号通路”中的von Willebrand因子（VWF）、软骨寡聚基质蛋白（COMP）和肌动蛋白5（ACT5）的表达在冬季时明显下调。我们假设在冬眠期间，由于甲状腺激素的下调，营养物质的使用和生理状态会有很大的改变。
图2 扬子鳄冬眠过程中参与多种组织能量代谢的途径中基因表达的变化。A-G分别代表甲状腺激素合成途径；在雌性鳄鱼的肝脏和小肠中参与营养消化和吸收的途径以及相应数量的冬季抑制DEGs；参与脂质代谢（绿色背景突出）、碳水化合物代谢和氨基酸代谢的途径中的基因表达模式；参与心脏收缩和心脏病的DEGs；参与骨骼肌收缩和发育的DEGs；参与肾功能途径中的基因表达模式以及参与脾脏免疫和疾病的途径。
1.2 消化和吸收
小肠主要负责食物的消化和吸收，而脂肪在肝脏合成的胆汁酸的帮助下被消化。KEGG途径分析表明，“初级胆汁酸生物合成”（肝脏）、“脂肪消化和吸收”、“维生素消化和吸收”以及“矿物质的吸收”（小肠）在冬季抑制的DEGs中显著被富集（q<0.05）（图2B）。在与消化和吸收相关的途径中，与上调的DEGs相比，我们观察更显著的下调DEGs。这些结果表明，在冬眠期间，小肠的消化吸收和肝脏胆汁酸的生物合成和分泌受到抑制，这与扬子鳄冬季的禁食状态是一致的。
1.3 营养物质代谢
碳水化合物是动物的主要能量来源，通过糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（三羧酸循环）和氧化磷酸化降解生成ATP。在这三条通路中，在冬季被抑制的DEGs明显多于被激活的DEGs（图2C，q<0.05）。特别是，编码糖酵解限速酶（6-PFK）和柠檬酸循环（CS、IDH和OGDH）的基因在大多数组织冬眠期间显著下调（图2C）。丙酮酸激酶基因（KPM和KPLR）在大多数组织中表现出有限的季节性差异，而血清中的KPM和KPLR蛋白在冬眠期间显著下调，这表明这两个因素在转录后调节。糖原作为一种能量储存形式，主要储存在肝脏和肌肉中。在冬眠期间，肝糖原合成酶基因GYSL的表达显著下调，但肌肉糖原合成酶基因GYSM或糖原磷酸化酶基因（GYPL、GYPM和GYPB）的表达没有显著下调（图2C）。相反，肌肉糖原磷酸化酶基因GYPM的表达也有上调，但没有统计学意义（q=6.85*10-36，fold change=1.48）。这些结果提示冬眠期间禁食可抑制碳水化合物分解代谢和肝糖原合成，但储存的糖原可能作为一种储备能量来源。脂肪是能量储存的另一种形式。与哺乳动物不同，脂肪分解途径在冬眠过程中没有上调；相反，在冬眠的扬子鳄中，脂肪代谢途径基因的表达普遍下调。在雌性扬子鳄的脂肪和肝脏组织中，参与脂代谢调节的“PPAR信号通路”在冬季DEGs受到抑制的情况下显著富集（q<0.05）。脂蛋白脂酶（LPL）将脂肪组织、心脏和骨骼肌中的三酰甘油水解生产脂肪酸（FA）和甘油，而激素敏感脂肪酶（HSL）对膳食脂肪起到水解作用。在冬眠期间，LPL在脂肪组织、心脏和骨骼肌中的表达受到抑制，而HSL的表达没有明显变化（图2C）。包括FATP家族、FABP家族、GOT2和CD36在内的参与脂肪酸运输和吸收的基因在冬季下调（图2C）。脂肪酸的氧化受限速酶CPT1A（肝脏）和CPT1B（心脏和骨骼肌）调控。在冬眠期间，CPT1A2上调，而CPT1B下调（图2C）。这些结果表明，虽然在冬眠过程中储存脂肪的利用率有所下降，但扬子鳄在肝脏中能更好利用的脂肪酸来维持其正常的功能和代谢活动，但通过减少心脏和骨骼肌中的脂肪利用来节省能量。与冬眠哺乳动物不同，这种独特的节能策略极大地上调了脂肪分解代谢相关基因，从而充分利用脂肪。脂肪酸的生物合成主要发生在肝脏中。在雌性扬子鳄肝脏中，KEGG途径“不饱和脂肪酸的生物合成”和“脂肪酸生物合成”在冬季受抑制的DEGs中显著富集（q<0.05）。特别是，关键基因ACC和FAS及其增强因子SREBP1和ChREBP在冬眠期间显著下调，而ACC抑制剂AMPK则上调（图2C）。这是绝食鳄鱼的节能策略。氨基酸主要在肝脏中代谢。氨基酸代谢基因在越冬扬子鳄中普遍下调。在氨基酸代谢途径中，冬季抑制的DEGs显著多于冬季激活的DEGs。冬季抑制的DEGs富含“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“色氨酸代谢”和“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”，包括转氨酶基因（GOT1、AGXT1、AGXT2、OAT、KAT1、AT2L1、GFPT1、Pyun和PSAT1）和谷氨酸脱氢酶基因（GLUD）（图2C）。这些结果表明，在冬眠期间氨基酸代谢受到抑制。
1.4 心肌和骨骼肌收缩
在冬眠期间扬子鳄的心脏跳动较慢。心肌收缩是由Ca2+内流引起的复杂过程。7个电压依赖性钙通道基因（CACNA1C-1、CACNA1C-2、CACNA2D2-1、CACNA2D2-2、CACNA2D1、CACNB4和CACNG2）在冬眠期间表达下调（图2D）。有趣的是，6个与心力衰竭有关的致病基因，即致心律失常性右心室心肌病的RYR2、DSP和PKP2，扩张型心肌病的DMD和MYBPC3，以及肥厚型心肌病的MYBPC3，在冬眠期间被抑制（图2D）。心肌收缩相关基因的下调为鳄鱼冬眠期间心率过低提供了分子机制。此外，我们还确定了与骨骼肌功能和发育有关的DEGs。其中，参与骨骼肌发育的PHKG2、MYLK3、KLHL40和MYF6在冬眠期间表达下调（图2E）。编码慢抽动骨骼肌成分的TNNI1、TNNC1、TPM2、TPM3、MYL3和MYH7在冬眠期间也被抑制，而编码快抽动骨骼肌成分的TNNC2、MYL1和MYH3在冬眠期间上调（图2E）。这些基因表达模式与我们之前的发现是一致的，即当鳄鱼受到干扰并从冬眠中醒来，但很快平静下来并再次入睡时。
1.5 尿排泄
随着代谢基因表达的显著降低，我们猜测冬眠期间肾功能相关基因的表达也会受到抑制。确实如此，KEGG通路“collecting duct acid secretion”和“proximal tubule bicarbonate reclamation”在冬季抑制的肾脏DEGs中显著富集（q<0.05）。这些DEGs包括编码CA2的基因（催化二氧化碳可逆的水合作用）；SNAT3、GLS和Glud（运输和催化谷氨酰胺产生NH4+）；以及近端肾小管细胞（NBC1、ATP1、ATP1B和AQP1）和集合管插入细胞（AE1、KCC4、CLCNKB和7个ATP酶）中的许多跨膜转运体（跨尿、跨细胞质和跨血液运输离子）。涉及水、钙和钠重吸收的各种基因（AQP2和ENACA，ENACB和ENACG）表达的下调，以及调节Ca2+通道的蛋白产物（VDR、PTHR和KL）（图2F），这些结果表明，冬眠扬子鳄的肾功能受到抑制。
1.6 免疫
脾脏是最大的免疫器官，是巨噬细胞和淋巴细胞的储存库，而巨噬细胞和淋巴细胞分别起清道夫和免疫防御病原体的作用。脾脏中冬季抑制的DEGs富含与免疫和造血相关的KEGG途径。特别是，下调的DEGs包括对淋巴细胞产生至关重要的基因（ADD、IL7R（NK细胞和前T细胞产生）、CD3E、CD45、CD8A（T细胞产生）、IgH、BTK和TACI（B细胞产生））（图2G），这表明淋巴细胞增殖在冬眠期间受到抑制。编码溶酶体酸性水解酶和溶酶体膜蛋白的各种基因明显下调。编码吞噬体组分的基因（包括MPO、NCF2、NCF4和CTL）被下调，表明吞噬作用在冬眠期间受到抑制（图2G）。此外，各种冬季抑制的DEGs还与感染性疾病有关（利什曼病、疟疾、哮喘、结核病、致病性大肠杆菌感染等）（图2G）。这些结果表明，由于冬眠扬子鳄停留在外源病原体较少的避难所环境下，免疫和造血受到抑制，以节省能量。
2 冬眠期间上调的因子
在扬子鳄中发现了几个在冬眠期间显著上调的因子。冷诱导的RNA结合蛋白基因（CIRBP）的表达可以简单地被冷胁迫诱导。在几乎所有的组织中，CIRBP的转录都活跃地上调。这些结果表明，尽管还没有完全阐明，但CIRBP在体外冬眠中发挥着关键的作用。出乎意料的是，c-FOS（神经活动标记基因），在冬眠期间，在除了甲状腺以外的大多数中枢和外周器官中过表达，这表明冬眠鳄鱼的活跃神经状态及其在冬眠期间的正向调节关系。此外，一般转录因子（GTF）基因在冬季普遍被激活（q=7.896E-005）。因此，冬眠期间参与甲状腺激素生物合成、营养吸收和代谢、尿液排泄和免疫的基因的下调很可能不是简单地通过GTF基因抑制来调节的，而是通过诸如DNA甲基化和miRNAs在内的更特殊和更复杂的途径来调节。
3 冬眠中的扬子鳄的DNA甲基化景观
平均每份组织样品中有24.43M甲基化胞嘧啶（mCs），占扬子鳄胞嘧啶（Cs）的2.49%。大多数mCs（96.66%）位于CpG位点中（图3A），而CHG和CHH位点中的mCs非常罕见，甲基化程度大大降低（图3A和3B），这与其他脊椎动物的发现一致（图3C）。因此，在随后的大多数分析中，我们将重点放在CpG位点上。不同基因组区域的DNA甲基化模式不同。在转录区及其上下游2kb处，启动子中CG甲基化水平最低，在转录起始点（TSS）处甲基化水平逐渐下降至最低，然后在5`UTR处再次升高。CG甲基化水平在外显子和内含子区域最高，但在3`UTR区略有下降（图3D）。这些结果提示DNA甲基化可能参与了转录启动的调控。我们还评估了GC岛、microsatellites、转座因子及其邻近区域的甲基化水平。转座因子中相对较高的CG甲基化水平表明活性转座子受到抑制（图3e）。冬季和夏季样品的整体DNA甲基化模式在甲基化广度和深度方面没有显著差异（p>0.05），表明冬眠中DNA甲基化的调节不是简单地通过整体高甲基化或低甲基化来实现的（图3F）。
图3 冬眠中的扬子鳄的DNA甲基化模式。A代表在每个序列中鉴定的甲基化细胞素（mC）的百分比；B代表每个指示序列中的平均mC水平；C代表六种脊索动物的mC密度和水平；D代表扬子鳄不同基因特征的DNA甲基化水平；E代表不同区域的DNA甲基化水平；F代表在不活跃（冬季）和活跃（夏季）时期，每个组织CG背景下的DNA甲基化水平。
4 DNA甲基化状态与基因表达的相关性
为了探索DNA甲基化对冬眠扬子鳄基因表达的潜在调控作用，我们将mRNA-seq数据与从相同组织中获得的BS-seq数据进行了关联。启动子CG甲基化与基因表达呈负相关关系。至于基因体及其下游的CG甲基化，未表达的基因的DNA甲基化水平最低，而中间表达的基因的DNA甲基化水平最高（图4A）。基因体甲基化水平最高的基因（图4B中的第四和第五组）倾向于在中等水平表达。这些结果表明，启动子高甲基化与转录抑制有关，而基因体甲基化在基因过度表达的正常化中起作用。为了探索冬眠扬子鳄DNA甲基组的变化，我们在冬季和夏季样本中鉴定了差异甲基化基因（DMGs）。除肾脏（q=0.054）（图4C）外，大多数组织中DEGs在DMGs中显著富集（q<0.0 5），表明DNA甲基化确实调节转录。一些涉及冬眠生理功能调节的基因出现甲基化改变。例如，CYP39A在冬眠期间在肝脏中的转录被显著抑制（图4D）。HLHL40和NCOR2在基因体中均发生高甲基化，但HLHL40在冬眠骨骼肌中表达下调，而NCOR2在肝脏中表达上调（图4D）。这些结果表明，DNA甲基化至少在一定程度上是冬眠期间适应性转录变化的原因，但它的作用比以前认识到的要复杂得多。事实上，高DMGs和低DMGs之间的相关性，以及DEGs的下调和上调之间的相关性，比预期的要复杂得多。例如，在冬眠期间，在肝脏中，有45个基因在冬眠期间被高甲基化并下调，而31个基因被低甲基化并上调。然而，31个高DMGs和46个低DMGs分别上调和下调（图4E）。此外，大量DEGs（2197）与DMGs没有重叠（图4E），表明这些基因表达的季节变化可能不受DNA甲基化的直接调控，而是由转录网络中甲基化依赖的改变引起的。
图4 扬子鳄冬眠过程中基因表达的DNA甲基化调控。A代表不同表达水平在基因体和2-kb上下游区域甲基化水平的分布；B代表甲基化和非甲基化基因的表达谱；C代表季节偏向差异表达基因（DEGs）与差异甲基化区域（DMRs）之间的相关性；D代表肝脏中季节偏向的DMGs和DEGs的Venn图；E代表不同基因表达水平。
5 冬眠期间TFS及其调控网络的DNA甲基化改变
为了研究冬眠期间甲基化改变在基因调控网络中的作用，我们对基于季节的DMGs进行了GO分析，该结果表明，在几乎所有的组织中，涉及基因表达和代谢过程调控的GO条目在基于季节的DMGs中显著丰富（q<0.05）（图5A）。我们在扬子鳄基因组中鉴定了1370个转录因子（TF）基因，并分析了它们在不同组织中与季节性DMGs的关系。我们所观察到，具有差异的甲基化TF与DMGs的比率显著高于我们所预期的（1,370/27,500）（q<0.05）（图5B），这表明参与基因表达调控的基因，特别是TF基因，更有可能被差异甲基化。为了探索冬眠扬子鳄中甲基化依赖的调控网络，我们鉴定了在每个组织中差异表达的TF和DMRs（图5C）。此外，我们根据转录组数据进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），并为每个组织构建了甲基化依赖的调控网络（图5D-E）。其中，大多数季节倾向的DEGs受到转录网络中差异甲基化的转录因子的调控。
图5 差异表达和差异甲基化转录因子（TF）基因的调控。A代表在脂肪组织中，季节偏向的差异甲基化基因（DMGs）中有30个最丰富的GO项；B代表差异甲基化TF基因与DMGs的比值；C代表差异表达的TFs与DMRs的相关性；D-E代表差异表达和差异甲基化TFs与心脏心肌收缩途径DEGs（D）和脂肪组织脂质代谢途径DEGs（E）之间的关系。
6 冬眠过程中miRNA的调控
有研究发现，miRNAs在冬眠期间的基因表达调控中发挥着关键作用。因此，我们对脂肪、脑、心脏、小肠、肌肉和性腺组织样本进行了sRNA-seq，以鉴定季节性差异表达的miRNAs。一些冬眠相关的miRNAs具有保守性，这些保守的miRNA同样在其他冬眠动物中发挥作用。例如，miR-103、miR-124（脑）和miR-206（骨骼肌）在冬眠的扬子鳄中表达上调（图6A），这些表达变化在冬眠的蝙蝠（Myotis Lucifugus）的相应组织中也有研究。我们还发现了新的与冬眠相关的miRNAs，其中一些属于与扬子鳄特有的miRNA（图6A）。miRNAs在基因表达调控中的作用具有组织特异性。在冬眠过程中，它们在不同组织中的表达水平不同（图6B-6D）。例如，miR-10b在冬眠期间在小肠和脂肪组织中上调，但在脑、心脏、肌肉和卵巢中下调（图6C）。miR-1a和miR-19a也观察到类似的模式（图6B和6D）。此外，这种表达模式表明某些miRNAs的作用具有物种特异性。MiR-200a在冬眠的扬子鳄的脂肪组织中表达下调（图6A），但据报道在冬眠的松鼠（Ictidomys Tridecemlineatus）中表达上调；MiR-1a在几种冬眠动物的肌肉中表达上调，但在扬子鳄中不表达。为了探索miRNAs在扬子鳄冬眠过程中的调节作用，我们预测了季节性偏向DEmiRs的靶基因。miRNAs针对每个组织中涉及冬眠期间功能调节的各种基因，这其中包括DGAT1、DGAT2、APOA1、APOA4、APOB、ABCG8、CD36、MTTP1、MTTP2、FABP2和SCARB1，这些基因与脂肪的消化和吸收相关，并在小肠中下调（图6E），此外，与脂质代谢相关的LPL、FATP6、SCD和GOT2基因在冬眠期间脂肪组织中下调。一个基因可以由多个miRNAs调控，反过来，一个miRNA可以针对多个基因，从而形成一个复杂的调控网络（图6E和6F）。
图6 扬子鳄冬眠过程中基因表达的miRNA调控。A代表由季节偏向的差异表达miRNAs（DEmiRs）在不同组织中靶向的功能关键基因；B-D分别代表 miR-1a （B），miR-10b （C）和miR-19a （D）的季节表达变化；E-F代表小肠脂肪消化吸收过程中差异表达基因（DEGs）（E）和脂肪组织中脂质代谢途径基因（F）与DEmiRs的关系。
虽然变温冬眠动物的体温似乎于恒温动物的体温十分的相似，但它们在行为、生理和生化特征上有很大的不同。在冬眠的哺乳动物中，冬季的代谢速率受到抑制，同时核心体温下降，这导致了实质性的节能；然而，冬眠期间的周期性间歇唤醒仍然消耗大量能量。另一方面，变温冬眠动物表现出持续的代谢抑制，超过了由于冬季环境温度降低所引起的被动热效应。哺乳动物进入冬眠时，伴随着营养物质从碳水化合物转向脂质这一使用上的转变，这提供了最高能量密度的代谢底物。先前对冬眠哺乳动物的转录组研究已经为这种转换提供了分子证据。例如，在野生种群中冬眠的自由放养矮狐猴的白色脂肪组织中，涉及脂质分解代谢（例如PLPP1、APOC2、SCD、FASN和ELOVL6）以及涉及碳水化合物氧化抑制（PDK4）的基因被诱导，而几个参与碳水化合物分解代谢的基因（PDHA1、PDHB、DLAT和DLD）有所下调。此外，在过去的三十年里，许多关于基因表达、表观遗传调控、蛋白质、酶和翻译后修饰的研究为哺乳冬眠动物营养物质用途的转换提供了证据。变温冬眠的主要能源和节能策略尚不清楚。与哺乳动物冬眠动物相似，据报道，普通蜥蜴（Lacerta Vivipara）和壁虎（Phyllotactylus Marmoratus）在冬眠期间依赖脂肪储存，但也有研究发现，限制侧斑蜥蜴（Uta Stansburiana）冬季生存的是糖原，而不是脂质。肝脏和肌肉储存的糖原在冬眠期间大量消耗，相当大程度上占了某些蜥蜴和蛇的冬季能量收支。对扬子鳄和澳大利亚中央须龙的心脏、骨骼肌和肾脏/大脑的转录研究已经确定了参与季节性适应和组织特异性功能维护的候选基因和途径，并为爬行动物冬眠背后的分子调控机制提供了有价值的见解。本研究中，我们将分析扩展到其他重要组织，包括大脑、下丘脑（中枢控制）、甲状腺（代谢调节）、小肠（营养消化和吸收）、肝脏（代谢）、脂肪（能量储存）、肺（气体交换）、心脏（血液供应）、骨骼肌（运动）和脾脏（免疫），以提供冬眠爬行动物的全面转录组图谱。我们的数据揭示了扬子鳄在冬眠过程中的一种独特的节能策略。为了适应禁食状态，冬眠扬子鳄抑制了涉及营养吸收和代谢有关的途径。总体而言，在冬眠的扬子鳄中，脂肪分解代谢途径中的基因除了肝脏CPT1A显著上调外，其余基因都显著下调，这表明在扬子鳄冬眠过程中，脂肪代谢途径通常是被抑制的。然而，肝脏中脂肪酸（FA）的β-氧化被激活，而肌肉中的FA没有被激活，这种通过利用有限的FA，保证了肝脏作为代谢中心的能量需求。我们在组织采集过程中发现，冬季和夏季的脂肪组织数量没有明显差异，这支持了这一点猜想。此外，糖原磷酸化酶基因在碳水化合物代谢中没有下调，相反，肌肉糖原磷酸化酶基因GYPM明显上调（q=6.85*10-36，倍数变化越1.48），这一结果表明，糖原，尤其是肌肉中储存的糖原可能是冬眠扬子鳄的另一种备用能量来源。我们的结果提供了这样一种分子证据，即在扬子鳄冬眠期间，碳水化合物和脂肪分解代谢受到抑制，而肌肉糖原的分解和肝脏脂肪酸的β-氧化为冬眠扬子鳄提供了稀缺的能量。通过促甲状腺素释放激素基因及其下游甲状腺激素生物合成途径的下调，冬眠期间营养吸收代谢、心肌和骨骼肌收缩、尿液排泄和免疫功能途径也普遍下调，反映了代谢率和生理状态的协同抑制。然而，这些途径中也存在一些上调的基因，例如CPT1A和AMPK（分别催化肝脏中FA的分解代谢和抑制FA的合成），以及与快速肌肉纤维收缩有关的上调基因（TNNC2、MYL1和MYH3），揭示了该物种巧妙的能量利用和生存策略。据报道，DNA甲基化在调节与哺乳动物冬眠相关的基因表达方面发挥着重要作用。转录因子（TFs）读取DNA甲基化并将信息翻译成特定的基因表达模式。TF本身也是各种生物过程中的DNA甲基化目靶标。MEF2C启动子区域的CpG甲基化水平与地松鼠骨骼肌基因表达下调相关。在花栗鼠中，USF结合位点上的CpG甲基化对于冬眠特异基因HP-27的肝脏特异性转录至关重要。虽然这些研究简单的了解了冬眠中DNA调控，但它们主要集中在总体DNA甲基化水平或特定基因甲基化的变化上。本研究中，我们对非冬眠以及冬眠期的样本进行了BS-seq（高分辨率DNA甲基化图谱的金标准），通过结合转录组和甲基组的数据，我们发现DNA甲基化的顺式和反式调节参与了冬眠过程中基因转录的变化。虽然差异甲基化基因（DMGs）可能是差异表达的，但大多数差异表达基因（DEGs）不是直接受到DNA甲基化变化的调控，而是通过与差异甲基化区（DMRs）的差异表达的TFs来调节。在这一经济而巧妙的策略中，扬子鳄可逆的急剧转录组变化是通过调节TF基因的转录来调节的。这些结果与在其他冬眠动物中的观察结果一致，在这些冬眠动物中，许多TF在冬眠期间发挥着重要作用，例如花栗鼠（Tamias Asiaticus）中的HNF-1，地鼠中的ATF4和NFAT以及蝙蝠（Rhinolophus Ferumequinum）中的ZBED1等。总的来说，我们的结果提供了关于扬子鳄冬眠的遗传和表观遗传机制的见解，并有望促进成功保护这一濒危物种的科学计划的发展。
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