科研 | Chemosphere：不同镉胁迫下甜菜夜娥卵巢的转录组分析（国人作品）
编译：Sophie，编辑：十九、江舜尧。
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重金属污染已成为全球日益严重的问题，其中镉污染居世界第一。昆虫的繁殖受到镉胁迫的剂量依赖性影响。但是，以前没有研究过镉胁迫对昆虫繁殖的影响的分子机制。本文中，利用转录组测序研究雌性甜菜夜娥卵巢基因表达的变化。在4种镉浓度下饲养甜菜夜蛾：对照0 mg/kg（CK）、低浓度0.2 mg/kg（L）、中浓度12.8 mg/kg（M）、高浓度51.2 mg/kg（H）。与对照（CK）相比，在L处理下，共鉴定出3453个差异表达基因（DEGs），包括1791个上调DEGs和1662个下调DEGs；在L vs M中，鉴定出982个上调DEGs和658个下调DEGs；在M vs H中，鉴定出6508个上调DEGs和2000个下调DEGs，并且通过qPCR验证了10个基因的表达模式。许多已鉴定的DEGs与保幼激素和蜕皮激素生物合成、胰岛素分泌、雌激素信号传导、氨基酸代谢和脂质生物合成有关。此研究将为了解重金属污染的生态风险提供分子背景，并为筛选关键基因作为害虫的基因编辑或沉默技术的靶点提供资源。
论文ID
原名：Transcriptome analysis of the ovary of beet armyworm Spodoptera exigua under different exposures of cadmium stress
译名：不同镉胁迫下甜菜夜娥卵巢的转录组分析
期刊：Chemosphere
IF：5.108
发表时间：2020.02
通讯作者：苏宏华
通讯作者单位：扬州大学园艺与植物保护学院
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2020.126372
实验设计
本文选取中国农业科学院植物保护研究所提供的甜菜夜娥（S. exigua）作为实验材料。制成含不同镉浓度的人工饲料（0.2、12.8和51.2 mg/kg），以加入相同体积ddH2O的饲料为对照。在实验室中于（27±1）℃、相对湿度（70±7）%、光周期14 h L: 10 h D的条件下饲养甜菜夜娥。在19 cm × 13 cm × 6 cm的纸盒中，用含不同镉浓度的人工饲料饲养幼虫，每个盒子里有20-30只幼虫。每处理三次重复。在雌成虫羽化后24小时内解剖卵巢，将卵巢保存在-70℃下以便后续使用。提取总RNA、检测RNA浓度、RIN值、28S/18S和片段大小，每个样品制备3 μg RNA进行转录组测序分析。每个处理收集六个卵巢，进行qPCR验证。设计并合成基因特异性引物，以Belta-action作为内参基因。通过2-∆∆CT法计算10个基因的相对定量来鉴定不同镉胁迫下样品的相对mRNA水平。
结果
1 卵巢样品的转录组分析及不同样品间皮尔逊相关性分析
为了揭示在不同镉浓度胁迫下雌性夜娥卵巢的转录水平，构建了13个cDNA文库。对13个cDNA文库进行质量控制得到clean reads（表1）。与CK相比，在L处理下，鉴定出3453个DEGs，其中1791个DEGs上调，1662个DEGs下调。与L处理相比，在M处理下，鉴定出1640个DEGs（982个上调和658个下调）。与M处理相比，在H处理下，鉴定出了8508个DEGs（6508个上调和2000个下调）。
表1 不同处理包含的reads数
不同样品间的皮尔逊相关系数是检测试验可靠性和样品选择合理性的重要参数。本文中，各处理的平均皮尔逊相关系数均较高。对照和各个镉浓度处理样品之间的皮尔逊相关系数较低，表明它们之间存在显著差异。
2 不同处理DEG数统计分析
与CK相比，L、M、H处理下分别有1791、2004、6845个上调DEGs和1662、1564、1722个下调DEGs。与L处理相比，M、H处理分别鉴定出982、7434个上调DEGs和658、1942个下调DEGs。与M处理相比，H处理鉴定出6508个上调DEGs和2000个下调DEGs。在H处理下，大多数DEGs显著上调。
3 DEGs的GO分析
DEGs功能分为三类：生物过程、细胞成分和分子功能。在CK vs L中，DEGs富集在17个生物学过程、15个细胞成分和10个分子功能中。在生物学过程中，大多数DEGs参与代谢过程、细胞过程、生物调节和应激反应。参与生殖和生殖过程的大多数DEGs下调表达。在细胞成分中，DEGs富集在细胞、细胞部分、膜和膜部分。在分子功能中，DEGs主要参与催化活性、结合和结构分子活性。
在L vs M中，DEGs主要富集在12个生物学过程、12个细胞成分和9个分子功能中。在生物学过程中，大多数DEGs主要参与代谢过程、细胞过程、应激反应和定位。参与解毒作用的DEGs都下调表达。在细胞成分中，DEGs富集在细胞、细胞部分、膜和膜部分。在分子功能中，DEGs主要参与催化活性、结合和转运活性。
在M vs H中，DEGs主要富集在23个生物学过程、13个细胞成分和10个分子功能中。在生物学过程中，DEGs主要参与细胞过程、代谢过程、生物调控和生物过程。参与生殖和生殖过程的DEGs都上调表达。在细胞成分中，DEGs富集在细胞、细胞部分、膜和细胞器。在分子功能中，DEGs主要参与结合、催化活性和分子活性。
4 DEGs的KEGG通路分析
DEGs参与的通路富集在细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和组织系统。在CK vs L组，环境信息处理中，241个DEGs参与信号转导，101个DEGs参与信号分子和通路互作。114个DEGs参与代谢通路，158个DEGs参与癌症通路，142个DEGs参与内分泌系统途径。
在L vs M组，环境信息处理中，105个DEGs参与信号转导，47个DEGs参与信号分子和通路互作；46个DEGs参与脂质代谢通路，84个DEGs参与癌症通路，62个DEGs参与内分泌系统通路。
对于M vs H组，在环境信息处理中发现了736个DEGs参与信号转导和186个DEGs参与信号分子和通路互作；178个DEGs参与脂质代谢通路，237个DEGs参与癌症通路，366个DEGs参与内分泌系统通路。
5 qPCR验证BGI测序结果
RNA-Seq获得的10个基因的表达水平与qPCR一致（图1）。
图1 qPCR验证BGI测序结果
6 不同镉胁迫下卵巢的脱皮激素生成基因和保幼激素调控相关基因的表达
本文鉴定出8种脱皮激素DEGs，包括：DIB、SDR16C5、DHRS4和DCXR。三个镉胁迫处理下的DIB（Unigene10817）的表达量均显著高于CK。在H处理下，DIB（Unigene13875、Unigene2325和Unigene11481）的表达水平均显著增加。在L处理下，SDR16C5的表达量明显受到抑制。在镉胁迫下，DHRS4（Unigene2892）的表达水平明显被抑制，而DHRS4（Unigene7939）的表达水平显著增加（表2）。还发现了9种与保幼激素相关的DEGs，包括：甲羟戊酸激酶（MVK）、法尼酸O-甲基转移酶（WASF2）、抑咽侧体素受体（SSTR2）、细胞色素P450 CYP305B1（CYP2L）、抑咽侧体素受体（ASTA-R）、保幼激素环氧水解酶（JHEH）和保幼结合蛋白（JHBP）（表2）。
表2 不同镉胁迫下卵巢蜕皮激素和保幼激素相关DEGs
7 胰岛素分泌和雌激素信号通路的相关基因
在L和M处理下PCLO基因的表达显著被抑制。与L和M相比，在H处理下的PCLO表达显著增加，但与CK相比还是被抑制。在三个镉浓度处理下，ADCY8、ABCC8和ATF2的表达受到抑制，而PKA的表达显著增加（表3）。在不同镉胁迫下，雌激素信号通路相关基因的表达收到不同程度影响。镉胁迫下，PKA的表达显著上调，而雌激素信号通路相关的其他基因的表达下调（表4）。
表3 不同镉胁迫下卵巢胰岛素分泌相关DEGs
表4 不同镉胁迫下卵巢雌激素信号通路相关DEGs
8 氨基酸代谢和脂质生物合成的相关基因
氨基酸代谢对于卵巢发育和产卵非常重要。一些基因如CL1069.Contig3和Unigene4730的表达在镉胁迫下显著下调，其他基因如Unigene4730和CL1219.Contig3的表达在H胁迫下大幅下调（表5）。脂质生物合成相关基因在不同镉胁迫下也受到不同程度的影响。LIPA（Unigene10215）在卵巢中大量表达，并且在H胁迫下其表达显著下调（表6）。
表5 不同镉胁迫下卵巢氨基酸代谢相关DEGs
表6 不同镉胁迫下卵巢脂质生物合成相关DEGs
结论
镉胁迫以剂量依赖的方式影响甜菜夜蛾的繁殖。本研究表明，镉胁迫下，在卵巢发育和卵子形成过程中（包括保幼激素和蜕皮激素的生物合成、胰岛素分泌、雌激素信号转导、氨基酸代谢和脂质生物合成）起重要作用的基因表达模式也受到剂量依赖性的影响。
评论
在重金属污染中，镉污染居世界第一，引起越来越多的公众关注。在昆虫中，从食物中摄入重金属是主要的途径，会影响昆虫种群动态。本文对甜菜夜蛾幼虫期不同浓度镉胁迫下卵巢的转录组进行了比较分析，鉴定出了许多在卵巢发育和卵子中起重要作用的DEGs，包括：保幼激素和蜕皮激素的生物合成、胰岛素分泌、雌激素信号转导、氨基酸代谢和脂质生物合成，并用RT-qPCR验证了10个与卵巢发育和卵子形成有关的DEGs。本研究通过转录组测序分析在转录水平上阐明了镉胁迫影响甜菜夜娥繁殖的分子机制的复杂性。
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