科研 | 中国农科院马鸣超＆李俊：中国黑土小麦根际长期施用氮肥后改变了13C标记的真菌群落组成但未改变其多样性
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植物根系分泌物是介导根际微生物与植物相互作用的重要物质。但是，在农业生态系统施氮肥条件下，微生物群落对根系分泌物的反应机制研究较少。本研究中，研究者利用稳定同位素探测技术将小麦根际土壤中的真菌分为两个生物区：13C标记的真菌群落和12C标记的真菌群落。随后利用高通量焦磷酸测序对这两个微生物群进行表征。研究结果显示长期施用氮肥改变了根际土壤的理化性质，增加了植物根系分泌物的数量；13C标记的真菌群落多样性低于12C真菌群落。在13C和12C标记的DNA中，真菌群落主要由子囊菌和担子菌组成，并且这两个门的丰度在13C标记的真菌群落中均高于12C标记的群落。非度量多维尺度分析（NMDS）表明，13C标记的真菌群落与12C标记的真菌群落存在明显差异。长期施氮肥改变了13C标记的DNA中的真菌群落，真菌病原菌的丰度较低而球囊菌门类群的相对丰度较高。虽然氮肥显著降低了12C标记的真菌群落多样性，但是对于13C标记的真菌群落多样性没有显著改变，说明微生物种类对根系分泌物的反应以及肥料的施用均对真菌多样性产生了影响。此外，在Partial Mantel试验的基础上，土壤化学性质对13C标记的真菌群落的影响小于对12C标记的真菌群落。总体而言，该研究结果表明，在本研究的生态系统中，长期施用氮肥增加了植物根系分泌物的数量并且改变了13C标记的真菌群落组成，但是未改变菌群的群落多样性。
论文ID
原名：Long-term N fertilization altered 13C-labeled fungal community composition but not diversity in wheat rhizosphere of Chinese black soil
译名：中国黑土小麦根际长期施用氮肥后改变了13C标记的真菌群落组成但未改变其多样性
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019.4
通信作者：马鸣超，李俊
通信作者单位：中国农科院农业资源与农业区划研究所
实验设计
1. 土壤采样
三种不同的氮肥处理，每个处理三个重复，分别为（ⅰ）不施肥（CK），（ⅱ）150Kg ha-1y-1氮肥，（ⅲ）300Kg ha-1y-1氮肥。实验初始阶段以尿素作为氮肥进行施用，每年在相同地点进行施肥处理。所有肥料都曾在秋收时作为基肥施用一次。经过37年的施肥处理，不同氮肥处理下土壤性状产生较大差异。
2. 氮肥对植物生长的影响及13C分析
小麦种子种植在一个由含有2-mm尼龙膜的两层30微米尼龙网形成的三个间隔区域的根袋内（图S1）。用CK、N1和N2施肥处理后的不同土壤填充根袋（温室实验期间不再施肥）。小麦种子以每盆8株的密度种植在C2室，C1、C3保持无根块状土状态。连续标记7天，利用同位素与质谱联用元素分析仪对小麦根系的13C标签进行测定。通过定量测定13CO2条件下小麦根际土壤中13C的富集程度来确定根系分泌物的水平，假设13C标记植物产生的根系分泌物是导致根系分泌物增加超过自然积累丰度的主要原因。
3. 土壤基因组DNA提取、梯度分馏和实时荧光定量PCR
使用Power soil DNA提取试剂盒从0.25 g土壤中提取总基因组DNA。DNA纯化后在Illumina HiSeq PE250平台上进行测序。
实验结果
1. 长期添加N使小麦13C根际沉积物增加
小麦根系13C标签仅在13CO2条件下的根际土壤中检测到（RS13C）（图S2）。土壤在RS13C（>126‰）中的δ13C值明显高于大部分土壤中13CO2条件（BS13C）（-17‰），根际12CO2条件（RS12C）（-19‰）和大部分土壤环境12CO2条件（BS12C）（-21‰）。但是土壤中BS13C、RS12C和BS12C之间的δ13C值没有显著差异。这些结果表明，小麦的13C根际沉积物成功地渗入到根际土壤中。在RS13C中，δ13C值随着N肥施用量从126‰增加到408‰而不断增加，高含量N肥处理比低含量N肥处理有更高的δ13C值，因此研究结果表明，N肥的施用能够促进植物分泌更多的根系分泌物到根际土壤中。
2. 梯度离心下核酸中13C的富集与分布
ITS丰度在12CO2微环境下当BD为1.720-1-725g ml-1时呈现出一个独特的峰值（图1）。在13C的环境下，ITS的丰度出现了两个峰。真菌群落明显向重组分（1.730-1.740g ml-1）转移，但不向轻组分转移（1.720-1-725g ml-1）。这些结果表明，真菌群落的根际基因组DNA中含有13CO2。不同氮肥处理下根际土壤中ITS基因的BD分布相似（图1）。基于以上结果，轻组分DNA的BD约1.725 g ml -1，重组分约1.735 g ml -1的DNA分别被认为是12C和13C标记的DNA（图1）。采用高通量焦磷酸测序法对CK、N1和N2处理下13C微系统中对12C和13C标记的DNA进行测序。
图1：真菌ITS序列拷贝数在不同N肥（CK、N1和N2处理）下的定量分布，分别用13CO2（黑色线条）、12CO2（灰色线条）表示。
3. 12C和13C标记的真菌物种多样性
对36个土壤样品进行真菌群落分析，共得到1426120个高质量序列（其中639343个来自13C-DNA，786777个来自12C-DNA）。Good’s覆盖度均超过99%，相似度甄别阈为97%，说明当前序列读取次数足以完成13C和12C的真菌多样性和组成分析。Mothur聚类结果表明，根际土壤中OTUs的数量在（242±54）-（501±83）之间，其中13C标记的（（242±54）-（324±36））真菌OTUs低于12C-DNA标记的真菌群落（（329±49）-（501±83））。
真菌alpha多样性由Chao1，OTUs和系统发育多样性评价，如表1和S1所示。13C标记的真菌alpha多样性明显低于12C标记的真菌群落（P<0.05）。在12C标记的真菌群落中，N肥处理显著降低了Chao1、OTU和系统发育多样性指数。在13C-DNA标记的真菌群落中，N1（150 kg N ha-1y-1）处理略高于CK处理，N2（300 kg N ha-1y-1）处理略低于CK处理，但N添加对其影响不显著（P >0.05）（表S2）。
采用非度量多维尺度分析方法（NMDS）分析了N添加和根系分泌物对真菌群落的影响。前两个轴分别代表真菌群落变异的56.40%（NMDS1）和31.62%（NMDS2）（图2）。每个样本中都有一个明显的单独的组，说明真菌群落受根系分泌物和长期N添加的影响，并且不同施肥处理条件下真菌群落对根系分泌物的响应不同。此外，NMDS1与13C和12C标记的DNA一般分布在真菌群落中，尽管NMDS2检测到不同N添加量栽培的植物样品中真菌群落的差异。这些结果表明，根际真菌群落的变异主要是由根系分泌物引起的，而非氮肥。
图2：基于非度量多维尺度分析（NMDS）的beta多样性分析。
4. 13C和12C标记的真菌群落
为了研究长期N添加对小麦营养物质和/或信号化合物对真菌群落的影响，采用高通量测序法分析了氯化铯（CsCl）密度梯度离心分离的13C和12C标记根际DNA片段。配对样本t检验表明，13C标记样本中子囊菌门和担子菌门的相对丰度明显高于12C标记的样品，分别为28.81%和77.86%；而13C与12C标记的样品相比，接合菌门和壶菌门的含量明显减少，分别为65.57%和144.44%（表2）。科水平上，在13C与12C标记的样本之间有10个科的菌群相对丰度之间存在显著差异（P<0.05）（表3）。在13C标记的样品中，孢菌科、发菌科、小戴卫霉科、Malasseziaceae和核瑚菌科的含量高于12C标记的样品。与12C标记的样品相比，毛壳菌科、毛球壳科、被孢霉科、壶菌科和小囊菌科为优势科，在13C中消耗较多。研究者进一步使用FUNGuild对真菌的功能进行注释。小麦根际中13C标记的病原菌相对丰度高于12C标记的病原菌（表2）。
不同施N量下13C标记的真菌群落存在差异（图3和图S2）。在门水平上，N2（17.8%± 8.2%）和N1（39.2% ±15.8%）处理中，子囊菌数量明显少于CK（59.8% ±14.3%）。在N2处理（31.8% ±7.2%）和N1处理（24.5% ±8.7%）中，Anthopthyta菌门的数量明显多于CK（12.9%± 8.0%）。CK组（0.3% 0.5%）的球囊菌门含量明显低于N1（1.5%± 0.9%）和N2组（1.2% ±0.8%）。我们使用FUNGuild方法对添加N对13C标记真菌病原菌相对丰度的影响进行了评估，结果表明CK（10.9%± 7.2%）和N1（8.2% ±3.9%）处理的真菌相对丰度显著高于N2（2.6% ±1.4%）处理。
图3：长期不同含量N处理下13C和12C标记的真菌中相对丰富度较高的7个门。
在科属水平上，13C标记的群落中多孢菌科相对丰度受N肥影响显著；CK（24.5% ±20.8%）比N1（5.5% ±2.4%）和N2（3.0% ±3.6%）处理菌群丰富度更高（图4）。此外，共检测出11种孢菌科的OTUs，其中9种OTUs又进一步分类为链格孢属、Edenia属、弯孢属、平脐蠕孢属、内脐蠕孢属和Dendryphia属。
在13C标记的群落中共检测到来自被孢霉科合胞菌属的10个OTUs，这些OTUs均为被孢霉属。被孢霉属菌群在CK中的含量（1.7% ±0.9%）高于N1（0.6% ±0.3%）和N2（1.2% ±0.5%）（图4）。
两个OTUs被分类为小戴维霉科，一个OUT进一步鉴定为枝孢属。小戴维霉科在CK中含量（3.2% ±2.1%）比N1（0.2% ±0.15%）和N2（1.4% ±2.5%）处理更加丰富（图4）。
两个OTUs属于壶菌科，该菌群在N2（1.05% ±0.57%）中含量高于N1（0.07% ±0.03%）和CK（0.06% ±0.05%）（图4）。
图4：长期不同含量N处理下13C和12C标记的真菌中10个科相对丰富度的差异（13C和12C标记中差异显著）。
5. 13C和12C标记的真菌群落结构相关因素
利用冗余分析（RDA）建立了13C和12C标记DNA中土壤性质与真菌群落结构之间的联系（图5）。在12C标记的DNA中，土壤性质只能解释63.53%的真菌群落结构变化差异，而在13C标记的DNA中，土壤性质只能说明44.53%的变异程度。结果表明，与12C标记的真菌群落相比，13C标记的真菌群落受N肥引起的土壤环境变化因子的影响较小。
在13C和12C标记的DNA中，N2处理下的真菌群落均与土壤养分（即，有效磷（AP）、全氮（TN）、SOM、铵（NH4+）、硝酸盐（NO3-）和根系分泌物）呈现正相关关系，其中根系分泌物是该模型中影响最大的因子。
利用Partial Mantel实验研究真菌群落结构与土壤变量之间的关系（表4）。真菌群落结构与所选土壤变量间相关性显著（P<0.05）。根系分泌物水平和土壤pH值是影响13C和12C标记DNA真菌群落结构的两个最主要因素，但在13C标记的群落中相关性低于12C标记的群落。
图5：土壤性质与12C（A）和13C（B）标记的真菌群落结构之间关系的冗余分析（RDA）。
讨论
1. 在13C和12C标记的DNA中，真菌群落各不相同
研究者首先假设13C和12C标记DNA的真菌群落是不同的，这是因为真菌群落利用根系分泌物的能力不同，根系的选择效应和真菌病原菌也有差异。本研究中，13C标记的真菌群落组成与12C标记的群落明显不同（图2），这在一定程度上也支持了这一假设。
13C和12C标记DNA之间真菌群落组成差异可以归因于不同真菌类群对根系分泌物的响应不同。子囊菌和担子菌群是小麦根际土壤的优势菌群，也是从植株中吸收C的两大类群。 这可能是因为基于DNA的方法有利于快速生长的真菌，如腐殖菌和霉菌，因为这种方法只允许检测那些使用光合作用生成的13C用于DNA修复或复制的真菌。子囊菌特别容易受到高营养水平的影响，该门中的一些类群参与了植物C吸收的过程。该门中的孢菌科、发菌科和小戴维霉科在13C标记的相对丰度明显高于12C，说明这些真菌在吸收小麦C源方面很活跃。担子菌门是可以有效利用根系分泌物的另一个门类，与之前的观察一致，担子菌可以从标记的植物根部渗出的碳中获益，并且能很好地适应高营养水平，特别是更顽固的化合物。该门类中的一些科（例如，Malasseziaceae 和Typhulaceae）的相对丰度在13C标记菌群中的相对丰度也高于12C标记的菌群。这些结果表明，所认为的r-对策者的群体和快速生长的真菌，其种群数量会随机波动，能够对土壤可用资源做出快速反应。植物来源的碳源不仅可能在吸引某些微生物方面发挥作用，还可能在竞争中减少某些微生物。本研究主要在12C标记的根际土壤中检测到两种接合菌门和壶菌门，与油菜中的研究结果一直。被孢霉属是接合菌的一种，在12C标记DNA中的含量更加丰富。结果表明，这两组均为r-对策者，并且对根际土壤有效资源相应较慢。
本研究中，13C标记的真菌alpha多样性指数（Chao1、OTUs和系统发育多样性）均低于12C（表1）。这可能是由于根系的选择性作用，本研究中以13C和12C分别标记的DNA中共分别有407个和273个真菌类群为例说明了根的选择效应（表1）。这种差异可能是由根系分泌物、有机酸、糖或植物激素引起的分子信号导致。例如Rudrappa等（2008）研究表明拟南芥可以分泌大量的苹果酸作为分子信号吸引枯草芽孢杆菌进入根际抑制病原菌。以往的研究表明，植物根系选择特定的微生物在根系上进行定殖以帮助植物提高养分获取效率和对抗病原菌类群。在本研究中，13C标记的DNA中发菌科（表3）菌群相对丰度较高，具有利用根系分泌物的能力，如有机磷，因此可以为植物矿物质营养提供来源。然而，其他研究表明根分泌物可以对微生物进行选择，其中包括土壤传播的病原菌。例如，Wu等报道了根系分泌酚类化合物（如香草酸）有利于真菌病原体的生长发育。在本研究中，FUNGuild分析也表明，在13C和12C标记的DNA中，致病真菌的相对丰度较高（表2）。此外，孢菌科在13C中含量明显高于12C，其中某些类群，如禾旋孢腔科，可以在根上定殖并引起根腐病。
2. 长期施用N改变13C标记DNA的真菌群落
在本研究中，不同氮肥处理下吸收根系分泌物的真菌群落组成不同。这可能是因为N肥改变了根系分泌物的质量和数量及其环境因素，因为这些变化都有可能改变微生物对C的吸收利用效率。本研究中，13C标记的真菌群落组成在不同施N量下存在显著差异（图2）。本研究发现，添加N标记7天后根际土壤中13C的含量显著增加，这与早期的研究结果一致，即增加N后根系分泌物的数量也会增加。根系分泌物的增加可能对根际土壤真菌群落的形成具有重要作用。尽管子囊菌的相对丰度在13C标记的DNA中高于12C，但是这些真菌类群，包括孢菌科、毛球壳科、小戴维霉科和小囊菌科随着N的增加其相对丰富度减小（图3A）。根据Wang等（2015）报道，在表层土壤中N对该门类菌群是有害作用，原因在于N的施用降低了土壤pH值，因而不利于该门大多数菌群的生长。例如，随着土壤pH值的降低，小囊菌颗的相对丰度显著降低。此外，研究表明真菌的丰富度，特别是子囊菌的丰富度与土壤C：N为显著正相关关系，说明子囊菌在施加N的土壤中生长时需要从根系分泌物中摄取更多的C以满足生长需求。由于子囊菌是农业土壤中重要的分解者，因此添加N后其丰富度的变化可能会显著影响根际养分的循环。与子囊菌相比，另一组使用13C标记的根际沉积物中担子菌群随着N含量的增加其丰富度增加（图3B）。一些担子菌种类，如蜜黄菇和疣革菌对增加N或高养分的土壤环境具有正向反应。这一结果也证实了之前的观察，即担子菌更适应高营养水平。因此，氮肥也是影响小麦根际土壤中13C标记的真菌群落变化的重要因素。
已有研究表明，长期施氮肥可促进已知致病特性的真菌群落的生长（Zhou等，2016）。本研究结果表明，长期施N肥不仅降低12C标记的真菌致病菌含量，还降低了13C标记的真菌致病菌；但是该研究结果需要进一步研究确认，因为很难推断病原菌是否在特定的生态系统中特定的植物中引起疾病。本研究还发现，长期添加N可提高13C标记的球囊菌的相对丰度。这可能与球囊菌从寄主植物中获得C并通过增加养分获取能力供应植物密切相关，William等也发现，随着N的增加，植物分配C给予球囊菌的比例增加。这一结果表明，氮肥增加了该土壤共生体的盛行。
3. 施用N对根际真菌对植物来源的C依赖性影响很小
尽管N的添加显著降低了12C标记DNA的真菌alpha多样性，但对于13C标记DNA的真菌alpha多样性没有显著影响（表2）。这与最近的一项发现相一致，即紧密附着在根上的根际土壤的真菌群落组成受环境因素的影响较弱。本研究还发现，长期添加N后，土壤环境因子（如，pH，TN和NO3-）的变化与12C标记DNA的真菌群落组成的相关性大于13C（表4）。结果表明，根际核心真菌主要由根系分泌物决定，环境因素对其影响较小。这可能是因为随着环境因素的变化，植物可以通过改变根系分泌物的数量或质量调节其根际真菌。其他一些研究也发现了类似的结果，例如Tedersoo等发现寄主植物是根际相关真菌物种丰富度和群落组成的最重要的影响因素。另一项研究对不同植物根系伴生真菌群落的分析表明，不同的植物根系提供不同的生态位，一些更喜欢这些生态位的根系伴生真菌在整个根系群落样本中数量最多也更倾向与利用光合作用产生的13C。这些结果表明，依赖植物源C的根际真菌没有发生变化，但施用N显著降低了12C标记的真菌的数量。该结果表明长期施氮对小麦根际依赖于植物源C的真菌影响不大，对根际土壤核心真菌复合体的影响不显著，小麦与其根际真菌群落之间存在相对稳定的联系。这是一个引人注目的结果，因为以前的研究表明，农业生态系统中微生物群落的多样性对维持农田地区的土壤质量、生产力和生态平衡至关重要。这种根际核心真菌多样性在不同含N量影响下仍然相对稳定的状态对于维持一个相对稳定的农业生态系统，以及可持续的农作物生产发展具有重要指导作用。
结论
本研究结果表明，在小麦根际土壤中由13C标记的根系分泌物主要被孢菌科、毛霉菌科和小戴维霉科菌群吸收利用。微生物群落对植物新鲜的根际分泌物（13C标记的真菌群落）的反应不同于以SOM（12C标记的真菌群落）为主的微生物群落，长期施氮改变了以植物新鲜根际分泌物为主的微生物群落的组成但没有改变其多样性。本研究结果也证明，长期施氮对小麦根际土壤中13C标记的真菌没有显著影响。本研究生态系统中，长期施氮肥作用下根系分泌物的增加或许维持了作物与真菌稳定存在的关系。这些发现强调了研究植物根系分泌物（数量和质量）如何影响根际真菌聚集及其形成机制的必要性。
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