科研| CIRC RES：肠道菌群衍生的短链脂肪酸可促进老年中风小鼠的恢复
编译：刘畅，编辑：谢衣、江舜尧。
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背景：中风会使老年人产生全身性后遗症，造成更高的死亡率和更严重的长期残疾症状。最近的研究表明中风可受到肠道微生物组的影响，但是，肠道微生物对中风后的肠道影响作用还未知。
目的：为了确定年轻的肠道菌群是否有助于老年中风小鼠的恢复，通过老年中风小鼠粪菌移植实验（年轻小鼠肠道菌群），改变其肠道微生物组。此外，通过更具针对性和完善的微生物组疗法探究直接产生短链脂肪酸（SCFA）的特异性微生物的功能。
方法和结果：老年雄性小鼠（18-20个月）通过大脑中动脉闭塞（MCAO）实验造成缺血性中风。在MCAO后3天，使用年轻小鼠肠道菌群（2-3个月）或老年小鼠的肠道菌群（18-20个月）进行粪菌移植实验。在中风后第14天发现，接受了年轻小鼠粪菌移植的老年中风小鼠的行为受损较小，且脑和肠道的炎症减少。基于微生物测序和代谢组学分析的数据表明，年轻小鼠粪菌中的SCFA水平和相关菌株相关性更高，选择四个SCFA生产菌进行移植（Bifidobacterium longum, Clostridium symbiosum, Faecalibacterium prausnitzii和Lactobacillus fermentum）。这些SCFA代谢菌减轻了老年小鼠的中风后神经功能缺损和炎症，并减轻了肠道、大脑和血浆中SCFA的浓度。
结论：本研究首次揭露，老年小鼠中风情况可被“中风后细菌疗法”恢复和逆转，即通过移植年轻小鼠肠道微生物，调节宿主的免疫和微生物代谢。
论文ID
原名：Gut Microbiota-DerivedShort-Chain Fatty Acids Promote Post-Stroke Recovery in Aged Mice
译名：肠道菌群衍生的短链脂肪酸促进老年小鼠的中风后恢复
期刊：Circulation Research
IF：14.467
发表时间：2020
通信作者：McCullough, Venugopal R. Venna
通信作者单位：德克萨斯大学休斯顿健康科学中心(休斯顿) 麦戈文医学院神经病学系
实验设计
老年雄性小鼠（18-20个月）通过大脑中动脉闭塞（MCAO）实验造成缺血性中风。在MCAO后3天，使用年轻小鼠肠道菌群（2-3个月）或老年小鼠的肠道菌群（18-20个月）进行粪菌移植实验。对于肠道内容物进行微生物测序和代谢组学研究，同时使用流式细胞法测定相关细胞数，并且测定大脑、血浆和肠道的SCFAs浓度。
实验结果
脑与肠间的双向通讯的研究基础为中风和其他神经系统疾病的研究开辟了新领域。这种双向通讯，称为微生物群-肠-脑（MGB）轴，为脑卒中的预防和治疗提供了新的途径。脑中风后，由MGB轴从大脑到肠道的通讯（自上而下的信号传递）被激活，尽管确切的机理尚不清楚，但明显的是中风会改变肠道的蠕动，增加肠道的通透性，激活免疫细胞，并将肠道微生物组转变为毒性更高的状态。肠道营养不良时，微生物群通过MGB轴与大脑沟通（自下而上的信号），加剧了中风的有害作用。这种自下而上的信号可能涉及到促炎细胞通过血液从肠道迁移到大脑。潜在机制包括源于肠道的细菌毒素或代谢产物传入神经网络，或者通过破坏的肠道屏障进入血液。
在实验性中风发生之前或之时，可通过粪菌移植（FTG）或抗生素改变肠道微生物组，且可显着影响其恢复。但是，目前尚不知道抗炎性FTG在当中风后数小时至数天时是否能有效发挥治疗效果。如果可有效改变中风后肠道微生物组，那么在中风时缺乏健康或抗炎性肠道微生物组的个体可通过粪菌移植治疗。
短链脂肪酸（SCFA）是细菌代谢肠道中的不易消化的纤维而产生的，SCFAs可通过激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白脱乙酰基酶来稳定肠道环境。已证明，粪便SCFAs在老年小鼠中减少约70％。因此，我们检验了这样的假设：我们可以通过益生菌和益生元恢复SCFAs的浓度，并改善实验性卒中后老年小鼠的症状。
老年中风小鼠的肠道微生物特征可复制供体肠道微生物的特征。16S rRNA测序分析两个FTG后的肠道微生物组成。线性判别（LEfSe）分析显示，年轻和老年供体小鼠之间的肠道菌群组成具有显着差异。另外，年轻小鼠肠道微生物主要包括放线菌属的双歧杆菌科（Bifidobacterium和Bifidobacteriaceae）和梭菌属的梭菌科（Clostridium和lostridiaceae）。主坐标分析（PCoA）发现移植的受体小鼠微生物组反映了不含抗生素的FTG不会影响受体小鼠的肠道菌群分布。与用年老的FTG饲养的小鼠相比，用年轻的微生物组定殖的老年中风小鼠的拟杆菌和拟杆菌属的含量较低。中风后年轻菌群的恢复可改善老年小鼠的行为，而与梗死面积无关。为了评估年轻肠道菌群的影响，首先评估了中风后第14天移植了年轻或老年FTG的老年受体小鼠的生理变化。发现MCAO后中风的患者和小鼠经历了体重减轻等生理变化，而到MCAO后的第14天，具有年轻生物群落的衰老小鼠已恢复到其中风前的体重（体重增加约3％），而衰老的FTG小鼠在14天后未恢复到其原始体重。但是，没有观察到两组之间的统计学差异。
图2. 中风后年轻粪便微生物组的移植改善了中风老年小鼠的行为。A，从年轻（2-3个月）和年龄较大（18-20个月）供体小鼠到中风小鼠（18-20个月）。年轻时的体重（B），使用开放视野测试（OFT，C）总运动能力，使用新型客观识别测试（NORT，D）的认知功能以及使用尾部悬吊测试（TST，E）的类压行为。并在MCAO之后的第14天老化了FTG（n=7）。在整个过程中，误差线代表平均值±SEM。对于重复测量研究，线性混合模型用于说明受试者内部相关性（B和C）。在每次调整多次测试后，进一步进行组比较。对于两组比较，在Shapiro-Wilk正态性检验（D和E）确定了数据的正态性，使用t检验。
测试年轻肠道微生物群能否改善老年小鼠中风后的结局，进行了一系列行为测试，包括：（1）自发运动活动的开放视野测试（OFT）；（2）认知功能的新型客观识别测试（NORT）；（3）中风后抑郁样表型的尾部悬吊试验（TST）；（4）吊线试验的握力；（5）神经功能缺损评分（NDS）作为中风后总体缺损的量度。在卒中后第14天，两组之间的NDS或吊线测试中均未有显着差异。然而，与移植了老年FTG的老年小鼠相比，具有年轻FTG的老年中风小鼠在OFT中表现出改善的运动活性，在NORT中具有更好的中风后认知。进一步确定了FTG对中风后抑郁表型的影响。年轻的菌群显着降低了TST，具有抗抑郁样作用。与中年FTG小鼠（20.3±2.5％）相比，年轻的微生物组移植组（19.7±3.1％），在卒中后14天通过脑萎缩测量的梗塞损害无显着差异。这些发现表明，在年轻的FTG的衰老小鼠中，在活动性（OFT），记忆力（NORT）和抑郁样行为（TST）方面改善的中风结局与梗死面积无关。
图3. 年轻的FTG可增加固有层（LP）中的肠道调节性T（Treg）细胞，并增强老年中风小鼠上皮中的粘蛋白生成。A，流式细胞仪图，用于鉴定老年中风小鼠肠道LP中的Treg细胞。将小肠（SI）和大肠（LI）的LP中的CD45+ CD4+Foxp3 +细胞门控为Treg细胞进行分析。使用胺反应性染色剂来鉴定活细胞和死细胞，仅活细胞被用于分析。图代表SI LP中CD4 + T细胞的Foxp3 +细胞的百分比。B，MCAO后第14天，老年中风小鼠肠道LP中CD4 + T细胞和Treg细胞的流式细胞术分析（每组n=5）。C，MCAO后第14天对老年中风小鼠的LI进行Alcian（AB-PAS）染色（每组n=4），并定量每10个上隐窝/小鼠的成熟杯状细胞数量。括号表示拥有成熟细胞的上部隐窝。比例尺：50μm。D，MCAO后第14天，对具有年龄（n＝4）和年轻的FTG（n＝5）的衰老小鼠进行FITC-葡聚糖肠通透性测定。将数据归一化为老年FTG对照组。E，在MCAO后第14天，老年中风小鼠中LI的上皮粘蛋白基因和Reg3基因的相对mRNA丰度（每组n＝4）。在整个过程中，误差棒代表平均值±SEM。根据Shapiro-Wilk正态性检验评估的数据的正态性，使用了t检验（B，C和D）和曼恩·惠特尼U检验（E）。
中风后的年轻FTG在肠道T细胞中赋予保护性表型并增强肠道完整性。在肠道中，微生物通过与几种类型的T淋巴细胞（特别是肠道固有层LP中的调节性T（Treg）细胞）通信来形成局部免疫系统，这些细胞具有抗炎作用并抑制免疫反应。分析了中风小鼠FTG后小肠（SI）和大肠（LI）的LP。流式细胞仪分析显示，患有年轻FTG的老年中风小鼠没有SI或LI LP中CD4 + T细胞的显着统计学差异。但是，年轻的FTG显着增加了SI LP中的CD4 + Foxp3 +Treg细胞。年轻和老年FTG组之间没有区别，表明通过FTG引入年轻的微生物群后，老年中风小鼠的肠道T细胞获得了调节表型。
图4. 年轻的FTG在中风小鼠的大脑中增加了Treg细胞并减少了IL-17γδT细胞的产生。A，代表性的流式细胞仪图，以鉴定Treg细胞（CD45 + CD4 +Foxp3 +）在老年中风小鼠的大脑中。B，MCAO后第14天，老年中风小鼠脑中Treg细胞的流式细胞仪分析（每组n＝5）。C，流式细胞图，用于鉴定中风小鼠大脑中的γδT细胞。在MCAO后第14天对IL-17 +γδT细胞进行了分析。使用胺反应性活/死水活度染色剂来鉴定活细胞和死细胞。使用脑卒中半球进行细胞分离，仅对活细胞进行门控以进行（A）和（C）分析。大鼠脑γδT细胞（D）和IL-17 +γδT细胞（E）的流式细胞仪分析MCAO后第14天的老年中风小鼠（每组n=5）。在整个过程中，误差线代表平均值±SEM。Shapiro-Wilk确认数据的正态性后，使用了t检验（B，D和E）正常性测试。
中风后年轻的FTG可增加老年大脑中的Treg细胞并减少IL-17 +γδT细胞。流式细胞仪分析显示年轻的FTG明显增强CD4 +中Foxp3的表达，老年中风小鼠同侧中风半球中的T细胞，表明年轻的微生物组可调节老年小鼠中风后的神经炎症。综上所述，年轻的FTG对老年人的有益影响，中风小鼠是通过外周（即与肠道有关）机制和中枢调节机制介导的，即通过调节大脑的炎症反应产生免疫力。
图5. 卒中后粪便中SCFA的浓度随着年龄的增长而降低，并且联合治疗产生SCFA的细菌和益生元菊粉改善了老年小鼠的行为障碍。 衰老降低了幼鼠（2-3个月）和老年（18-20个月）小鼠粪便样本中主要SCFA的浓度。收集粪便样品并使用质谱分析。图表代表单个SCFA的变化（年轻生物群落，n=9；老化生物群落，n=10）。B，为了检查菊粉和SCFA产生剂对中风结果的影响，用1）媒介物，2）菊粉，3）SCFA产生剂和4）菊粉+SCFA产生剂对四组单独的小鼠进行口服破坏。对于SCFA生产者，新鲜培养长双歧杆菌（1x107），共生梭状芽胞杆菌（5x106），praenitzii杆菌（1x106）和发酵乳杆菌（1x109）的混合物，并灌胃给小鼠。在MCAO后第14天进行神经功能缺损评分（NDS）（C），吊线测试（D）和TST（E）（单独的菊粉，n=3；单独的SCFA生产者，n=4；单独的菊糖，n=4；菊粉+ SCFA生产者，n=5）。对于TST，排除了来自媒介物和菊粉治疗组的两只小鼠（每组一只），这些小鼠由于严重的神经功能缺损而显示出旋转。NDS，hangwire测试和TST的总P值分别为0.0001、0.0004和0.0036。在整个过程中，误差线代表平均值±SEM。为了进行组比较，基于由Shapiro-Wilk正态性检验评估的数据的正态性，使用了Mann-Whitney U检验（A）和普通的单向方差分析或Kruskal-Wallis检验（C，D和E），然后使用Dunnett's多重比较测试。
中风后用SCFA生产菌进行粪菌移植可改善衰老小鼠的恢复能力。与年龄较小的微生物群相比，含有较高SCFA的年轻微生物群的预处理有助于改善受体小鼠的中风，卒中后SCFA的增加可以改善康复。为此，首先确定了本研究中用于FTG的粪便样本中的SCFA是否不同。质谱分析揭示了衰老与SCFA浓度之间存在反比关系：在卒中后用益生元（菊粉）和四种产生SCFA的主要细菌菌株（Bifidobacterium longum,Clostridium symbiosum, Faecalibacterium prausnitzii和Lactobacillusfermentum）的混合物对小鼠进行了处理。与老化的微生物组相比，双歧杆菌和梭状芽胞杆菌这两个属被认为是年轻微生物组的微生物特征。菊粉是一种可溶解的纤维，由于其可抵抗上消化道和SI的酶促降解，因此可以完整地到达结肠，是一种支持上述细菌增强SCFA产生的基质。具有菊粉与SCFA-生产菌的中风小鼠在中风后第14天时神经功能缺损评分显着改善。此外，当悬吊测试时，这组小鼠的运动协调性和强度有了显着改善。与年轻的FTG后看到的效果相似，使用菊粉的SCFA生产菌在老年中风小鼠中具有显着的抗抑郁作用。未发现单独服用菊粉的老年中风小鼠具有明显的行为益处，或单独的细菌，提示菊粉与细菌具有协同作用。
图6. 移植SCFA产生剂减少了老年中风小鼠大脑IL-17γδT细胞的产生。A，代表性的流式细胞仪图，用于鉴定老年中风小鼠的大脑（同侧中风半球）中的γδT细胞。在FTG研究中使用了相同的门控策略。在MCAO后第14天对老年中风小鼠的大脑γδT细胞（B）和IL17 +γδT细胞（C）进行了分析（每组n=5）。计算IL-17中值荧光强度（MFI）（D）。在整个过程中，误差线代表平均值±SEM。使用Mann-Whitney U检验（B，C和D）。
具有SCFA生产菌和菊粉的中风小鼠的大脑IL-17 +γδT细胞减少。发现细菌和菊粉治疗可显着降低IL-17，卒中后第14天为γδT细胞，而非γδT细胞，各组卒中后第14天的脑萎缩没有差异。
图7. 在SCFA生产者治疗的中风小鼠中的SCFA概况。在MCAO和Abx（第1天和第2天）和菊粉+细菌（第3天和第4天）处理后的第14天，从衰老的中风小鼠中收集样品。粪便（菊粉+细菌，n=8），血浆（菊粉+细菌，n=8）和大脑（菊粉+细菌，n=8）的变化。使用质谱仪评估代谢产物。在整个过程中，误差线代表平均值±SEM。根据Shapiro-Wilk正态性检验评估的数据的正态性，使用了Mann Whitney U检验和t检验。
增强的肠道SCFA可改变中风小鼠的全身和大脑SCFA谱。免疫组织化学结果表明，中风小鼠接受SCFA产生菌和菊粉后，沿上皮细胞显着增强了LI杯状细胞中表达的Muc2蛋白。表明SCFA可能是年轻微生物组中有益于老年小鼠中风后恢复的关键成分。
讨论
在这项研究中，确定了年轻菌群的FTG可显着改善老年中风小鼠的症状，这种保护与增强肠道屏障的完整性和减轻炎症反应有关。在肠道和大脑中，老年微生物组中细菌来源的SCFA减少导致了老年小鼠中风后免疫状态增强和预后弱化。在年轻的微生物组中使用产生SCFA的细菌（益生菌）和食物来源（益生元）发现SCFA恢复到一定水平后，卒中预后明显改善。微生物组重塑与宿主免疫反应增强有关，肠道微生物可以调节CD4 + T细胞分化为抗炎调节性T（Treg）细胞或促炎性效应子-T细胞。本研究中，年轻的微生物群增加了肠道Treg细胞，这些数据证明，即年轻人针对老年人的肠道，微生物群移植可以改善肠道和大脑健康。
肠上皮由单层EC组成，它们负责黏膜免疫和稳态，并在与腔内细菌和抗原的对话中起着不可或缺的作用。杯状细胞是上皮细胞中独特的细胞群，仅在肠道顶侧产生粘蛋白，在管腔和宿主组织之间形成物理屏障。重要的是，年龄对肠道的通透性和中风产生负面影响。本研究发现，年轻微生物群增强了衰老小鼠粘蛋白基因Muc2和Muc4表达的能力。因此，用益生菌恢复粘蛋白是一种有前途的治疗选择。
结论
原文网址：https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.119.316448