科研 | Water Research:鄱阳湖边部分城市和工业污水处理厂的抗生素抗性基因和细菌群落特征(国人作品)

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编译:小白同学,编辑:小菌菌、江舜尧。

原创微文,欢迎转发转载。

导读

污水处理厂主要汇集了工业废水和城市生活污水,其中含有大量抗生素抗性基因ARG和耐药细菌ARB。针对ARG和细菌群落的多数研究都集中在城市生活污水处理方面,而工业污水处理厂ISTP则鲜有问津,不同来源污水对ARG环境行为的影响尚未受到充分关注。

本研究采用二代测序和高通量PCR技术对鄱阳湖周边2个城镇生活污水处理厂MSTP和1个工业污水处理厂ISTP废水中的抗生素抗性基因、可移动遗传元件MGE和细菌群落进行了研究,探讨了其影响因素。

结果表明,两种类型的污水处理厂中ARG、MGEs和细菌群落结构存在差异,主要原因可能在于进水水质(如铅含量等)和水力停留时间HRT(MSTP较长)不同。由于在水力停留时间较长情况下ARG和ARB去除效果较好,通过适当延长ISTP水处理工艺中的HRT或可提高ARG和ARB去除率。通过对两种类型污水厂中ARG、MGE和细菌群落特征的深入了解,本研究为控制ARG和ARB的传播扩散提供了理论依据。 ·

论文ID

原名:Characterization of antibiotic resistance genes and bacterial community in selected municipal and industrial sewage treatment

译名:鄱阳湖边部分城市和工业污水处理厂的抗生素抗性基因和细菌群落特征

期刊:Water Research

IF:7.913

发表时间:2020.02

通讯作者:丁惠君

作者单位:江西省水利科学硏究院

实验设计

本研究采集了鄱阳湖沿岸2个城镇生活污水处理厂(CYW和GQW)和1个工业污水处理厂(XLW)的废水和活性污泥样本。GQW位于鄱阳湖近岸小镇共青城,2018年常住人口13万;CYW处理南昌市的城市生活污水,南昌2017年常住人口546万;XLW位于南昌市的一个工业园区,内有印染、制药、机械加工、食品饮料四类企业。三个污水厂位置和主要处理工艺如图1所示,CYW和GQW采用氧化沟法;而XLW第一阶段采用SBR工艺,第二阶段采用循环污泥法CASS。2018年7月,一年中细菌最活跃的夏天,从各污水处理厂采集进水、出水和污泥样本。氧化沟法(CYW和GQW)的进水和污泥样品分三个时间点采集,每点间隔1h,取三个平行样品;相应的出水样品则根据水力停留时间(HRT)确定何时采集。对于ISTP (XLW),进水、出水和污泥各取样一式三份。进水和乙醇以1:1体积比(终体积600毫升)混合在一1.5 L聚乙烯瓶中,以固化污水中微生物;对于污泥(来自CYW和GQW的氧化沟活性污泥和来自XLW的CASS活性污泥),在50ml的离心管中以1:1体积比(最终体积40 mL)和乙醇混合;出水每个污水处理厂取2 L。样品在冰盒中运抵实验室,部分进行预处理,部分储存在- 80°C冰箱留待提取DNA。利用双输入多参数数字分析仪(HACH HQ40d, USA)测定水质参数,包括温度(T)、电导率(EC)、氧化还原电位(ORP)和溶解氧(DO);总氮(TN)、NH4+、NO3-、总磷(TP)和PO43-按国标方法分析测定。特定的水质指标,氯、总钙、总镁、油脂、镉、铅、铜、锌和18种抗生素含量于2019年11月采样后的24 h内分析测定。

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图1 本研究中鄱阳湖周边污水厂(GQW、CYW、XLW)的地理位置及主要处理工艺。
进水和污泥样品经洗涤离心后根据说明书用FastDNA®试剂盒提取DNA;800 mL出水过0.2µm硝酸纤维滤膜以富集微生物,剪掉多余部分并裁成3mm×30mm薄条,用试剂盒提取DNA。50µLDNA洗脱液置于-80°C冰箱存放待用。使用Wafergen SmartChip实时高通量PCR系统测定ARG和MGE,共296对引物(283个ARG、12个MGE和1个16s rRNA基因),序列查自抗生素抗性基因数据库和国家生物技术信息中心数据库。HT-qPCR反应体系由SYBR Green I Master Mix (Roche, USA)、牛血清白蛋白、引物、不含核酸酶的PCR级超纯水和模板DNA组成,终体积100 nL 。HT-qPCR条件:95℃-10 min,30 s×40个循环,退火60℃-30 s,检测限阈值为31,在2-3个平行处理中检测到扩增即为阳性。计算ARG或MGE的基因拷贝数后除以16S rRNA基因拷贝数得到其相对丰度(copies/16S rRNA基因);用Microsoft Excel 2010计算其均值、标准差和FC倍数;用Origin 9进行方差分析和Tukey检验并绘制柱状图。Illumina测序(上海美吉):用引物515F和907R扩增细菌16S rRNA基因的V4-V5区域,电泳后进行胶回收并纯化,产物在Illumina MiSeq平台上按标准方法进行双端测序。使用QIIME(版本1.17)对原始读数据进行过滤,去除低质量序列并拼接,OTUs为根据UPARSE 7.1确定的97%相似性阈值进行聚类所得的,用UCHIME去嵌合后比对SILVA 16S rRNA数据库,用RDP分类器对16S rRNA基因序列进行分类,置信阈值为70%。测序数据利用美吉在线分析平台(www.i-sanger.com)进行Adonis检验、Welch t检验和NMDS分析;用R的PCMCR包进行Kruskal-Wallis秩和检验和post hoc比较;用Canoco 4.5进行冗余分析(RDA)。

结果

1 ARGMGE检出情况

样本中主要检测到9种类型的ARG,包括氨基糖苷类、β-内酰胺酶类、FCA、MLSB、磺胺、四环素、万古霉素(除GQW外)等类的抗性基因,在283个ARG中检测到207个,进水、污泥和出水样本中检测到的总ARG拷贝数如图2所示。各污水处理厂中,ARG值在进水样品中最高,其次是出水样品,活性污泥中最低。两MSTP (GQW和CYW)的进出水样本总ARG拷贝数相近,显著高于ISTP (p<0.05),而两种类型污水厂中污泥样品的ARG含量无统计学显著差异。其中,氨基糖苷类(15.35-26.41%,平均20.89%)、β-内酰胺酶类(15.58-24.07%,20.41%)和四环素类(16.45-20.59%,18.27%)抗性基因是三种最主要抗性基因类型。使抗生素失活(平均为52.44%)是最主要的耐药机制,其次是编码外排泵(28.67%)和细胞保护(16.53%)。各样品中9类ARG的相对丰度(靶基因拷贝数/16S rRNA基因拷贝数)如图3所示,污水厂中相对丰度较高的ARG是氨基糖苷类和多药耐药基因,平均丰度分别为0.32和0.22 copies/16S rRNA。这里,XLW进水样本中上述两类基因相对丰度最高,分别为0.77和0.61copies/16S rRNA。比较三个污水厂,进水样品中ARG丰度无显著差异;而污泥样品中,XLW的ARG丰度显著高于GQW和CYW (p<0.05),分别是GQW和CYW的7.7倍和6.9倍。此外,对于两MSTP,GQW出水中ARG丰度显著少于CYW;两MSTP的ARG丰度呈现出进水>出水>污泥的模式,与相关研究报道情况一致。

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图2 各样本中检测到的ARG拷贝数,XLW、GQW和CYW分别为各组活性污泥样本,虚线表示分组,不同字母表示差异有统计学意义,p<0.05。

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图3 各样品中ARG的相对丰度,XLW、GQW和CYW分别为各组活性污泥样本,虚线表示分组,不同字母表示差异有统计学意义,p<0.05。细菌群落在门水平上的丰度。

本研究中测得的12个MGE的含量在GQW进水、污泥、出水中分别为9、8.8±0.4和9;CYW中分别为9、8.3±0.5和7.7±0.6;XLW中分别为9.7±0.6、7.7±0.6和8,XLW进水样品中MGE丰度最高(0.52 copies/16S rRNA)。XLW污泥样品MGE丰度显著高于GQW和CYW污泥样品(p<0.05);各污水厂中,从进水到出水的MGE丰度都显著下降。

细菌群落特征

Shannon和Simpson指数用于评估细菌多样性,Chao1和Ace指数用于评估细菌丰富度。XLW 细菌α多样性(所有样本平均香农指数)为5.27,GQW 和CYW分别为5.12和5.03,XLW组进水细菌多样性明显高于两MSTP(Welch t检验,p<0.01)。从Shannon (p<0.01)和Chao1 (p<0.05)分别可以看出,两MSTP的出水和污泥样品的细菌多样性和丰富度均显著高于各自的进水样品,而ISTP样品则没有显著性差异。样品中聚类所得5433个OTU分布于17个门(图4),其中变形菌门(53.62%)、拟杆菌门(17.44%)、绿弯菌门 (9.86%)、厚壁菌门(4.23%)和酸杆菌门(2.93%)最为常见,这种组成情况在全球生活污水中都很相近。这里XLW中以变形杆菌(64.51%)和绿杆菌(11.39%)为主,CYW中以变形杆菌(47.80%)和拟杆菌(27.00%)为主,GQW中也以变形杆菌(49.71%)和拟杆菌(24.24%)为主,即ISTP的细菌群落组成与两MSTP不同。通过降维分析发现在OTU层面两MSTP的进水、污泥和出水样品分别聚集在一起,而XLW的样品都在下方靠拢(图5),这表明处理生活污水的GQW和 CYW细菌群落结构更相似,尽管他们之间存在处理容量、水力停留时间和其它操作参数的差异。XLW样品中物种的Bray-Curtis距离与其他三个分组有显著差异(Adonis, p=0.001),说明污水处理厂类型,或者说废水种类对微生物群落结构影响较大。

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图4 门水平上的物种丰度,XLW、GQW和CYW分别为各组活性污泥样本。

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图5 基于Bray-Curtis距离的NMDS分析,XLW、GQW和CYW分别为各组活性污泥样本。

3 ARGMGE丰度的影响因素

鉴于污水厂中ARG影响因素的复杂性,我们用RDA法评估细菌群落和水质参数对ARG及MGE丰度的影响(图6)。八个主要门类中,拟杆菌(蒙特卡罗置换法,p = 0.008)、Prevotella_9 (p = 0.046,属于拟杆菌门)和Thauera (p = 0.024,属于变形杆菌门)是影响ARG丰度最主要的三个物种(图6-a)。MGE对ARG的丰度也有显著影响(p=0.002,图6a),这表明在该环境中发生了基因的水平转移,且MGE在抗性基因扩散中发挥了一定作用。变形菌被证明是在众门类中质粒和整合子最佳的栖身之所,在样品中含量丰富,有利于可移动遗传元件施展拳脚。通过分析常规水质指标与ARG、MGE的相关性发现,EC (p=0.002)、TN (p=0.004)、PO43- (p=0.006)、ORP (p=0.028)对于水质有重要指示作用(图6b)。从图6b还可以看出,两MSTP的进水样品主要受TN和PO43-的影响,而XLW的进水样品与EC和ORP关系更密切。由于供试污水厂已运行多年,流量相对稳定,我们也通过补充实验的监测数据,进行了特定指标和ARG及MGE之间的相关性分析,以进一步探讨水质指标对ARG及MGE的影响(图6 c)。抗生素对ARG和MGE丰度的影响不显著(p>0.05),而重金属则有一定影响。Pb对二者丰度的影响显著(p=0.002),主要存在于XLW进水中(图6c),由于金属离子与EC强相关,进而EC与XLW进水相关性强,这与上述分析结果相一致。

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图6 样本间相关性的冗余分析(RDA)。(a) 8个主要菌属和MGE与ARG。(b)传统水质指标与 ARG和MGE。(c)特定水质指标与 ARG和MGE。(b)和(c)中,样品1、2、3为CYW进水;4 5 6为CYW出水;7、8、9为XLW进水;10、11、12为XLW出水;13、14、15代表GQW进水;16、17、18为GQW出水。

追踪污水厂中潜在的ARB

如上所述,出水和污泥中ARG丰度较进水显著降低(图2、图3),因而相对含量也降低的细菌或为潜在ARB。对其中丰度最高的15个细菌属进行多重统计检验和两两比较,发现CYW和GQW污泥样品中Prevotella_9和拟杆菌的丰度显著低于进水样品(Kruskal-Wallis H检验和Dunn 's检验,p<0.05),被认为是潜在的ARB。在XLW中,细菌各属丰度在进水和出水之间,进水和污泥样品之间均无显著差异。然而,包括norank_fanaerolineaceae、Thauera、Denitratisoma等在内的几个属的丰度,由污泥到出水明显减少。综合考虑这些菌属的丰度以及它们对ARG和MGE丰度影响的RDA分析(图6-a),Thauera被认为应该是XLW中主要的潜在ARB。综上,不同类型污水厂中占主导的ARB物种不同。

讨论

ARG在环境中普遍存在,虽然这里经污水厂处理后可以有效降低ARG丰度,但大部分的ARG亚型在进水和出水中都能被检测到(图2),这表明水处理流程难以降低ARG多样性。污水厂中主要ARG有氨基糖苷类、β-内酰胺酶类和四环素类抗性基因,万古霉素抗性基因总体丰度较低,GQW出水中没有万古霉素抗性基因,这与该地区万古霉素使用量少相一致。ISTP的ARG、MGE和细菌群落特征与两MSTP不同,所有污水厂中,氨基糖苷和多药耐药基因是最丰富的两类ARG,尤其在ISTP进水中检测到的最多。这可能是由于ISTP所处的工业园区有生产氨基糖苷类抗生素的药企,制药废水在该污水厂XLW处理。有研究者确定了社会经济参数与氨基糖苷、多药及磺胺类耐药基因的丰度之间存在显著相关性,多药耐药基因与重金属污染水平也密切相关。此外,在真实环境的复杂体系中,抗生素、重金属和其他环境压力可能联合作用于多药耐药质粒克隆子及细菌的选择。本研究中,ARG、MGE和细菌群落的差异可能是由两种类型污水厂进水水质组成的差异造成的。具体而言,两生活污水厂进水更富营养,而ISTP因受Pb等重金属污染更具“毒性”(图6b,6c)。XLW的进水也含有较高的MGE丰度,这也印证了曾被报道过的化学污染与MGE之间、MGE与ARG丰度之间的正相关关系。该研究中,intI-1和tnpA-04是污水厂中两主要MGE,intI-1和acrR-02(多药,含所有样本,Pearson相关系数r=0.9785)存在显著相关关系,且tnpA-04和aacC2(含全部样本,Pearson相关系数 r= 0.8787)间存在强相关性。intI和tnpA基因常被用作MGE的标记物,整合酶基因intI-1能够帮助传播ARG,在超过70%的革兰氏阴性病原菌中均有发现。XLW中大量氨基糖苷类抗性基因可能是通过转座子的基因水平转移实现传播的。

XLW进水的细菌多样性(Shannon指数)明显高于两MSTP的进水,这可能一定程度上是由于和工业废水中污染物一同引入的微生物,然而在污水厂混合后高浓度的重金属大大降低了ISTP中的微生物多样性。而在两MSTP中,细菌多样性却增加了,这很可能是由于其富营养环境造成的。不同进水的水质可以选择出适宜该水质的优势菌群,如Akkermansia和Prevotella主要存在于生活污水中。这里两MSTP中最可能的ARB是Prevotella_9和Bacteroides,ISTP中则为Thauera,这也可能是由于两种类型污水厂水质不同造成的。此外,除了进水水质对ARG、MGE和细菌群落的影响外,不同的处理工艺,包括采用的消毒方法,也可能在其中发挥了作用。基于一系列相关研究,这里认为生物法处理污水可以有效去除ARG和ARB,同时去除程度也取决于不同的处理容量、流程和操作参数,采用活性污泥法以较长的HRT和较高的固体负荷有助于提高生物去除效率。MSTP中,细菌群落的组成随污水处理进程发生显著改变,而ISTP变化不大,这可能是由于两MSTP水力停留时间(12-24h)比ISTP(240 - 320min)长,较长的水力停留时间或可解释两MSTP的ARG去除率高于ISTP的现象。通过两MSTP之间的比较也可进一步验证此猜想:在进水样品的ARG丰度无显著差异的情况下,相对于CYW (12-14h),GQW (24h)的HRT更高,GQW出水的ARG丰度显著低于CYW出水(p<0.05)。综上,延长循环污泥法的水力停留时间是强化去除ISTP中的ARG和ARB的可行策略。

结论

本研究采用HT-qPCR和Illumina测序技术,研究了ISTP和MSTP中ARG、MGE和细菌群落的特征。与两MSTP相比,ISTP中的ARG、MGE和细菌群落结构较为不同,很可能是由于进水水质不同所致,特别是ISTP进水存在Pb污染。或者这种差异也可能是由于两种类型污水厂水处理工艺中的水力停留时间不同造成的。结果表明,延长循环污泥法工艺中的水力停留时间或为提高ISTP中大量ARG和ARB去除效果的可行策略。由于本研究仅为鄱阳湖地区的个案研究,未来还需要更多其他地区相似类型污水厂的监测数据,以全面了解污水处理过程中ARG和细菌群落的多种行为模式。本研究结果将有助于制定有针对性的措施来控制ARG和ARB在环境中的传播扩散。



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2021-04-11 原文

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