利用纳米胶囊编辑植物基因组 - -期待安全基因组编辑的实用化
物理化学研究所利用纳米胶囊编辑植物基因组- -期待安全基因组编辑的实用化-
理化学研究所(理研)环境资源科学研究中心生物高分子研究小组的小田原真树研究员、土屋康佑客座研究员、沼田圭司小组组长等的研究小组，利用纳米大小的囊体——多离子复合物型向量( PICsome ) [1]中内含的Cas9核糖核酸蛋白质[2]，开发了植物愈伤组织[3]的基因组编辑[4]技术。由于愈伤组织可以在多种植物中诱导，并且可以再生为植物体，本技术有望成为实用植物中通用性强、安全的基因组编辑技术。直接向植物细胞输送Cas9核糖核酸蛋白质的基因组编辑，作为安全性更高的基因组编辑技术备受瞩目。 但是，由于在导入时利用了电穿孔法[5]和PEG (聚乙二醇)法[6]，因此能够适用的植物种类有限。此次，研究小组成功地使蛋白质内含于用细胞透过性肽( CPP ) [7]修饰了表面的PICsome(CPP-PICsome )内，并在维持蛋白质活性的状态下有效地将其纳入植物愈伤组织的细胞内。 另外，应用本传递法，通过将Cas9核糖核酸蛋白质摄入植物内，开发了编辑植物愈伤组织基因组的技术。本研究刊登在科学杂志《ACS Applied Nano Materials》在线版( 6月3日)上。
将纳米胶囊中内含的Cas9 RNP送达植物愈伤组织细胞内，进行基因组编辑
背景近年来，由于基因组编辑技术的发展，在各种生物中基因组编辑成为可能，特别是Cas9/CRISPR系统从基础到应用得到了广泛的应用。 基于Cas9/CRISPR的基因组编辑，在很多生物中是通过导入Cas9基因进行的。 但是，如果将Cas9核糖核酸蛋白质直接传递到细胞内，脱靶[8]就会变少，而且也不用导入外源基因，因此成为了更安全的基因组编辑技术。作为将Cas9核糖核酸蛋白质直接输送到植物细胞内的方法，已知有电穿孔法和PEG (聚乙二醇)法，但都使用除去了细胞壁的细胞(原生质)。 由于可从原生质再生植物体的植物有限，需要可以用于更多植物的通用性高的传递法。 植物愈伤组织是可以从许多植物的各种组织中诱导出来的未分化细胞，而且可以从其中的一部分再生植物体，因此被认为适合作为进行通用性高的基因组编辑的材料。
研究方法和成果研究小组着眼于一种叫做多离子复合物型囊体( PICsome )的纳米大小囊体，由半渗透性膜构成，可以内含各种生物高分子，是将蛋白质和Cas9核糖核苷酸蛋白传递到植物细胞内的载体。 首先，将以氨基酸为骨架的聚合物混合制作PICsome的同时，成功地使该PICsome内含荧光蛋白质的Citrine蛋白质(图1 )。
图1典型的PICsome的电子显微镜图像(左)和切片的电子显微镜图像PICsome约为200纳米( nm，1nm为10亿分之一米)的球状，通过切片可以确认内部的空洞。为了提高向细胞内的送达效率，制作了在PICsome的表面附加了细胞透过性肽( CPP )的CPP-PICsome。 将内含Citrine蛋白质的CPP-PICsome导入模型植物拟南芥愈伤组织中，通过共聚焦激光显微镜[9]确认了Citrine蛋白质向细胞内的有效摄取(图2 )。 另外，用CPP-PICsome处理的细胞显示出90%以上的高存活率，由此也表明了该方法的细胞毒性之低。
图2 CPP-PICsome中内含的Citrine蛋白质的细胞内定位。共焦点激光显微图像。 以CPP-PICsome为载体内含Citrine蛋白质(荧光蛋白质)，导入拟南芥愈伤组织细胞后，发现Citrine蛋白质有效地进入了细胞内。接着，用荧光色素标记的Cas9核糖核酸蛋白质包含在CPP-PICsome中，导入到愈伤组织中。 共聚焦激光显微镜观察结果表明，由CPP-PICsome导入的Cas9核糖核酸蛋白质能有效地进入愈伤组织细胞内(图3 )。
图3 CPP-PICsome中内含的Cas9核糖核酸蛋白质( RNP )的细胞内定位共焦点激光显微图像。 以CPP-PICsome为载体内含Cas9RNP，导入拟南芥愈伤组织后，发现Cas9RNP有效地进入了细胞内。为了分析由CPP-PICsome导入Cas9核糖核苷酸蛋白质的愈伤组织的基因组编辑，进行了靶序列PDS3基因的深度测序分析[10]。 结果，在导入Cas9核糖核酸蛋白质的愈伤组织的PDS3基因上，观察到了由基因组编辑引起的典型变异(图4 )。
与野生型的PDS3基因序列相比，从导入Cas9核糖核酸蛋白质的愈伤组织中，可以发现DNA切断导入部位有缺失( 1个碱基缺失)，或者伴随插入的缺失( 1.4个碱基缺失/4个碱基插入)。
今后的期待在本研究中，通过将细胞渗透性肽与多离子复合物型向量结合，成功地将内含的荧光蛋白质在维持其活性的状态下高效地传递到了植物愈伤组织的细胞内。 进一步，通过将Cas9核糖核酸蛋白质包含在多离子复合物型载体中，开发了对愈伤组织进行基因组编辑的技术。利用多离子复合物型载体将蛋白质传递到细胞内，可以期待应用于利用多离子复合物膜半透过性的生理学研究。 另外，利用该技术基于Cas9核糖核酸蛋白质的基因组编辑，作为通用性强、安全的基因组编辑技术，期待着对各种实用植物的品种改良做出贡献。
补充说明1 .聚离子复合物型向量( PICsome )带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物用水溶液混合，聚合物通过静电相互作用聚集形成的囊泡(囊泡)。2.Cas9核糖核苷酸蛋白质Cas9/CRISPR系统的Cas9蛋白质和指南RNA的复合体。3 .愈伤组织可由植物各种组织诱导的未分化细胞团。 可以通过在植物伤口上形成或加入植物激素来诱导。4 .基因组编辑利用核酸分解酶(核酸酶)改变基因组上靶位点的技术。5 .电穿孔法向细胞施加短脉冲电流进行穿孔，从那里导入核酸和蛋白质的方法。6.PEG (聚乙二醇)法一种去除细胞壁，使PEG作用于原生质化的细胞，从而导入核酸和蛋白质的方法。7 .细胞通透性肽( CPP )能透过细胞膜转移到细胞内的肽的总称。 由10~100个左右的氨基酸组成。 CPP是蜂窝互联时段的缩写。8 .关闭目标改变靶位点以外的基因组序列。9 .共焦点激光显微镜能够获取高分辨率荧光图像的显微镜的一种。 通过组合光轴方向和二维扫描型的信息，还可以构建立体图像。10 .深度测序分析采用新一代测序法，以数千和数万的重复度读取基因组和基因组上特定位置的碱基序列的方法。
研究小组理化研究所环境资源科学研究中心生物高分子研究小组队长沼田圭司(泷井圭司)(京都大学研究生院工学系研究科教授)研究员小田原真树特别研究员(研究当时)渡边健太(渡边健太)特别研究员(研究当时)河崎陆客座研究员土屋康佑(京都大学研究生院工学系研究科特定副教授)技术人员(研究当时)立石彩香客座研究员儿玉丰(宇都宫大学生物科学教育研究中心教授)
研究支援本研究是在科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业总结实施型研究ERATO“沼田细胞反应集群项目(研究总结:沼田圭司)”的支持下进行的。原论文信息Masaki Odahara，Kenta Watanabe，Riku Kawasaki，Kousuke Tsuchiya，Ayaka Tateishi，Yoko Motoda，Takanori Kigawa，Yutaka Koda Mand “用于服务质量保护和CA S9森林保护的设备小区的Nanoscale poly ion complex服务”，ACS应用程序号
发表者物理化学研究所环境资源科学研究中心生物高分子研究小组研究员小田原真树客座研究员土屋康佑队长沼田圭司(泷井圭司) 小田原真树的照片
小田原真树