基因过表达细胞株详细构建流程

LentiCRISPRv2-GOI过表达载体构建

利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体，采用双酶切的方式获得线性化载体，根据同源重组设计目的片段的引物。目的片段的获得分为两步PCR方法，第一步从模板中扩增出目的片段的ORF，第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。采用one step cloning试剂盒连接目的片段与线性化载体，利用Amp进行抗性筛选。

1、基因序列扩增（图1）

图1 基因序列第一轮扩增

2、基因序列扩增，添加标签及同源序列

3、双酶切pLentiCRISPRv2载体

图2   目的基因第二轮PCR及线性化载体纯化结果

4、目的基因与线性化载体连接

利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。每个实验组各挑取单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，并送样测序。

5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取

病毒包装

1、培养细胞，配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液，将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15～20 min。

2、将上混合液小心滴加到培养基中，轻轻晃动摇匀，在培养箱中继续培养18 h。

3、18 h后小心吸去培养基，加入5 mL新配制的完全培养基。

4、42 h后收集培养上清，离心，0.45µm滤膜过滤，液氮速冻，-80℃保存。

细胞转染

1、配制梯度病毒稀释液

2、在六孔板中加入病毒稀释液，随后立即加入细胞，摇匀，以下每孔依次按此操作进行。细胞于培养箱中静置培养48 h。

阳性单克隆细胞株筛选

1、细胞转染48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次。

2、筛选7天后，对照组细胞全部死亡，实验组细胞扩大培养，同时进行单克隆细胞筛选。

3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养

静置培养48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次，每日观察并记录单克隆形成情况。

7天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证——Western blot

图3 阳性单克隆细胞株基因表达验证——Western blot

基因测序验证

提取单克隆细胞株基因组DNA，测序验证基因稳定转染单克隆细胞株的基因序列的准确性。