科研 | 四川大学：全长转录组揭示藏红花在脱辅基类胡萝卜素合成途径的进化（国人佳作）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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二代测序（SGS）广泛用于发现藏红花的新功能基因，如不同发育阶段的转录本发现了新的CCD类型基因，不同组织部位的转录本揭示了调控脱辅基类胡萝卜素的结构基因和转录因子。但是二代测序对读长的限制影响了转录本的完整性，而三代测序（TGS）/单分子测序（SMRT）可读取全长mRNA序列，其中著名的PacBio测序平台可一次读取10Kb碱基。目前PacBio测序广泛用于功能基因挖掘和可变剪接鉴定。
本研究采用PacBio测序对比藏红花5个组织（球茎、叶片、花被片、雄蕊、柱头）的全长转录组。由于目前缺少藏红花的完整基因组，本研究将对藏红花的进化地位，尤其是脱辅基类胡萝卜素生物合成的进化，提供新颖的见解。
论文ID
原名：Full-length transcriptome sequencing provides insights into the evolution of apocarotenoid biosynthesis in Crocus sativus
译名：全长转录组揭示藏红花在脱辅基类胡萝卜素合成途径的进化
期刊：Computational and Structural Biotechnology Journal
IF：4.720
发表时间：2020.03
通讯作者：刘永胜
通讯作者单位：四川大学生命科学学院
DOI号：10.1016/j.csbj.2020.03.022
实验设计
结果
1、全长转录组测序获得高质量数据
从开花期的藏红花植物组织提取总RNA进行PacBio测序，共产生1133474条reads，其中596356（52.61%）为完整的转录本，质控后剩余138773条高质量reads（准确率>99%）。片段总长介于800 – 4000 bp，相比先前研究使用的二代测序（610-1047 bp），全长转录组分析更有优势。将所有转录本在GenBank数据库进行比对，比对率为93.9%。BUSCO质量评价结果表明完整的转录本占核心的保守真核基因的73.06%（图1A），覆盖率较高。由于全基因组序列尚未破译，高质量的全长转录组有助于识别编码区域并描述藏红花的进化历史。
结合同源预测及从头预测，本研究发现31755个蛋白编码基因（GC含量约48.66%），编码序列平均长度918bp。其中30197个基因在二代测序中同样获得，而29422个基因获得数据库注释（图1B）。获得注释的基因中，1130个鉴定为转录因子，涵盖64个基因家族，其中C3H家族基因最多，其次为bHLH、bZIP、MYB家族基因。先前研究表明含有锌指基序的转录因子与脱辅基类胡萝卜素的调控有关，本研究共鉴定了88个C3H和56个C2H2家族基因，占所有转录因子的13%。
此外本研究预测了非编码RNA，包括821个rRNA、393个tRNA、38个snoRNA、15个snRNA和10个miRNA。将miRNA与编码基因进行比对，共确定645个候选靶标，其中锌指转录因子的靶标较多，说明这些miRNA可能与脱辅基类胡萝卜素有潜在关系，而并不直接靶向生物合成基因。此外，本研究鉴定226616个SSR，主要为A/T重复，编码基因中有3714个SSR，说明非编码区的SSR更丰富（图1C）。
2、全长转录组比较分析揭示全基因组复制事件
为了揭示物种进化过程中的全基因组复制事件，本研究将藏红花的序列与11个代表性物种比较，包括猕猴桃（Actinidia chinensis）、凤梨（Ananas comosus）、芦笋（Asparagus officinalis）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、无油樟（Amborella trichopoda）、茶树（Camellia sinensis）、胡萝卜（Daucus carota）、野芭蕉（Musa acuminata）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays），共获得19131个同源基因家族，包括311825个基因，其中177574个基因（6486个家族）在所有物种共有，代表其核心性（图2A）。此外，有9841个基因（48个家族）是藏红花里特有的，表明其物种物种的独特性（图2A）。GO富集分析表明这些特有基因与'代谢途径’和'催化活性’相关（图2B），其中有些代谢途径与藏红花的主要次级代谢物有关（藏红花素、藏红花苦甙、藏花醛），而催化活性主要为氧化还原酶、水解酶、类胡萝卜素加双氧酶。
在开花植物中，基因家族的增加/缩减是物种分化和多样性的驱动力。本研究表明基因家族在物种适应性进化的过程中发生明显地变化，一些特有的基因促成了藏红花特有的性状和品质。系统发育分析表明了藏红花的进化地位，在同源基因家族中保留了8357个家族，其中2843个家族获得新基因拷贝（图2C）。这些基因富集于'电子传递链’，包括磷酸烯醇丙酮酸激酶活性、电子传递、呼吸电子传递链。电子传递链的功能与天冬氨酸、抗坏血酸、茄红素、类胡萝卜素的代谢密切相关。因此，'电子传递链’基因的新拷贝可能有助于藏红花的代谢能量供应，促进脱辅基类胡萝卜素的合成。此外，富集域还有'含雄性不育蛋白功能域’的基因，这表明藏红花不育三倍体的形成与自然选择有关。从全长转录组中确定了15900个基因的复制事件，并通过同义替代率（Ks）预测事件发生时间（图2D）。
3、藏红花在脱辅基类胡萝卜素合成途径的进化
藏红花的柱头有较高的商业价值，包括三种主要次级代谢物：藏红花素、藏红花苦甙、藏花醛。为了深入了解其分子机制，本研究用比较转录组进行分析。根据转录组数据的酶编码基因的注释，发现了参与脱辅基类胡萝卜素生物合成的功能基因，包括9个类胡萝卜素生物合成基因（GPPS, GGPPS, PS, PDS, Z-ISO, ZDS, CrtISO, β-LYC, BCH），和4个类胡萝卜素裂解的基因（CCD, UGT, ALDH, β-GS），这些基因在许多物种中保守存在，证明了脱辅基类胡萝卜素的合成途径的保守性。
然而，脱辅基类胡萝卜素的含量在物种间相差巨大，藏红花中大量存在。生化分析表明，藏红花中通过7,8/7’,8’位裂解玉米黄素产生藏花醛和藏红花苦甙（由CCD基因家族产物催化），多数物种在9,10/9’,10’位裂解（图3A），证明了CCD基因家族的独立演化性。在转录组中共预测了13个CCD家族基因，数量明显比其他物种的基因组注释多（图3A）。选择5个物种的38个CCD基因进行系统发育分析（图3B），可分为4个聚类，其中有3个类在单子叶植物和双子叶植物中共有，表明CCD基因的存在非常古老，但同时同一物种的基因趋于同一分支，这表明基因复制事件发生于物种分化之后，这些复制事件使它们在进化过程中表现特定的功能。在藏红花中，裂解玉米黄素7,8/7’,8’位键的关键酶基因鉴定为CsCCD2，聚类于CCD1分支（图3B），说明是由物种分化后复制形成的。
对藏红花5个组织（球茎、叶片、花被片、雄蕊、柱头）的基因表达谱分析表明，CsCCD2在所有组织内表达，而在柱头中水平显著较高（图3C）。这证明CCD基因在柱头中的特异表达性。通过对柱头组织和其他4个组织的基因表达进行两两比较，鉴定差异表达基因，基因数量从87至1366，可见不同组织的转录具有动态性。但藏红花的脱辅基类胡萝卜素的合成的时空转录调控有待进一步研究。
结论
在藏红花的全基因组测序未完成的情况下，本研究提出高质量的全长转录组测序，且显著提高了编码基因的序列完整和功能注释。同时，转录组数据解释了藏红花的进化历史，尤其是主要次级代谢产物（脱辅基类胡萝卜素）基因的进化，结果表明关键酶CCD2由藏红花进化产生。研究结果有助于进一步研究藏红花基因和作物改良。
藏红花中含有大量藏红花素、藏红花苦甙、藏花醛，是重要的经济作物。本研究用PacBio全长测序技术获得三倍体藏红花全长转录组。结果表明全基因组复制事件使得藏红花中脱辅基类胡萝卜素的积累，且藏红花获得了由CCD家族进化而来的基因CCD2，且表达水平极高，这揭示了藏红花在脱辅基类胡萝卜素合成途径的进化。
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