科研| ANAL CHEM：增强源内裂解注释可实现新的数据非依赖采集和自动METLIN分子定性
编译：Ms. MS，编辑：谢衣、江舜尧。
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在建立电喷雾电离（ESI）质谱方法时，源内碎裂一般会被最小化以促进前体分子离子的形成，因此其在分子定性中的价值常常被低估。本文针对增强源内裂解是否能辅助分子定性进行了深入研究。
首先，作者在Q-TOF上以50个分子为例，对比了增强源内裂解注释模式（eISA）与数据依赖采集模式（DDA）和数据非依赖采集模式（DIA）产生的二级质谱图。与DDA模式相比: eISA得到的前体离子的峰强更高; 对于90%以上的分子，eISA产生碎片的相对强度和质荷比与METLIN上的二级质谱图一致。与DIA模式相比：60%的负电荷前体离子和88%的正电荷前体离子在eISA方法下具有更高的峰强度。随后，作者通过分析巨噬细胞的提取代谢物再次验证了eISA的定性能力。同理可知，这种eISA方法提高了基于低分辨单四极杆质谱的非靶向分析定性的置信度。
综上，eISA可以作为比Q-TOF DDA和DIA模式更敏感的替代方案；并且其使ESI飞行时间质谱和ESI单四极杆质谱采集到的谱图具有更高的分子定性置信度。
论文ID
原名：Enhanced in-Source Fragmentation Annotation Enables Novel Data Independent Acquisition and Autonomous METLIN Molecular Identification
译名：增强源内裂解注释可实现新的数据非依赖采集和自动METLIN分子定性
期刊：Analytical Chemistry
IF：6.350
发表时间：2020.4
通讯作者：Gary Siuzdak
通讯作者单位：Scripps Center for Metabolomics and Department of Molecular and Computational Biology
实验设计
实验结果
1源内裂解条件优化
为了达到可靠的化合物定性需求，首先在不影响前体离子强度的情况下，优化质谱条件，以产生更多碎片离子（图1）。同时，将METLIN库中标准品在碰撞电压20eV条件下所得的二级质谱图作为优化结果的参照。
实验过程中以50种浓度为30μM的内源性代谢物标准品为模型， BRUKER impact II 型质谱仪中离子漏斗1和2之间的传输源内碰撞诱导裂解能量（isCID）作为被优化的参数，变化范围0-100 eV，步长10eV。
结果表明，在负离子模式下，50种化合物均可被检测到；而在正离子模式下只能检测到其中33种。参数isCID的选择主要考虑三个因素：eISA谱图与对应标准品在METLIN库中的二级质谱相匹配的片段数、相对强度以及前体离子的强度。最后，选择30和40eV分别作为eISA正负离子模式下的isCID条件。
图1. ESI负离子模式下，尿酸在eISA模式和METLIN中未增强源内裂解模式的二级质谱图（20eV）的比较。
2 eISA与Q-TOF DDA模式的比较
高分辨质谱靶向采集的二级质谱被认为是化合物定性的黄金标准。因此，作者分别采集了eISA和Q-TOF DDA（20eV）模式下的裂解数据以相互比较。
比率得分和匹配因子两个指标被用来评价eISA和Q-TOF DDA模式下裂解碎片的相似性。其中，比率得分的分母为DDA模式下采集到的碎片总数，分子为eISA模式下采集到的碎片数（表1）。因此，如果eISA谱图的一级碎片匹配上越多的DDA谱图的二级碎片，这两种谱图的相似度就越高。在碎片相对强度高于5%的前提下，eISA谱图和DDA二级谱碎片完全匹配的负离子模式有34个（共50个）、正离子模式有17个（共33个）。而当碎片相对强度高于30%时，以上数据分别为负离子模式有46个（共50个）、正离子模式有30个（共33个）。因为相对强度高于30%的主要碎片离子在二级谱图比对中至关重要，由此说明了对于92%的模型代谢物而言，eISA能产生与DDA相当的碎片。此外，通过计算模型代谢物三个以上碎片的匹配因子，作者进一步评估了这两种方法产生的裂解谱图的相似性，不同于比率分数，匹配因子考察的是碎片的强度。如表1所示：匹配因子在负模式下从10%到100%（中位数：87%），在正模式下从14%到100%（中位数：71%），表明这两种方法下大多模型分子的质谱碎裂图具有良好的相似性。
随后，作者比较了两种方法下碎片的峰强。在eISA负离子模式的碎片中，49%的碎片具有较高的绝对强度，中位数为0.91倍；67%的碎片在正模式下具有较高的绝对强度，中位数为1.7倍。这表明，eISA模式下产生的大多数碎片的强度与DDA模式下的相当或更高。
非靶向代谢组学研究通常包括两组实验：代谢物一级质谱分析和二级质谱分析。在一级质谱分析中，通常会尽量减少源内裂解，以减少来自源内裂解碎片的假阳性数；然后选择特征离子生成其二级质谱。
上述结果表明，通过增强源内裂解，可以在不影响前体离子强度的情况下，获得与20 eV的二级质谱相当的定性推论。值得注意的是，与eISA相比，DDA模式高能碰撞下多数前体离子的绝对强度显著下降。总而言之，在eISA模式下所有前体离子的绝对强度都比在DDA模式下的要高得多，分别为负模式下的18倍和正模式下的210倍。实验中以四种代谢物为例（正离子苯丙氨酸和色氨酸，负离子果糖-6-磷酸和氧化谷胱甘肽），描述了eISA和DDA模式下产生的前体离子和碎片离子的强度定量关系（图2）。在eISA 一级谱中，这种高丰度的前体离子可以追踪生成碎片的母离子。
eISA模式的效能之一是碎片离子可以在较宽的离子强度动态范围内产生。而DDA模式下，低强度的前体离子会影响二级碎片的形成。为了研究两者灵敏度的差异，分别在eISA和DDA的正负离子模式下分析了一组混标，其9个浓度跨越6个数量级：1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 和1 mM。其中，在DDA的负离子模式下，10 μM的酪氨酸谱图中丢失了两个相对强度分别为42%和27%的碎片，同时观察到许多高丰度干扰碎片，这在定性过程中可能会引发问题。然而，在eISA模式下，生成了两个相对强度分别为100%和90%的主要碎片，即使酪氨酸浓度仅1 nM，其前体离子依然具有较高的丰度。
总的来说，与Q-TOF DDA质谱方法相比，eISA可以在一次运行中生成包含前体离子及其碎片的全扫描质谱，它还能够最大限度地收集低浓度代谢物的信息，即使其在DDA模式中可能被遗失。而在eISA模式下产生的一级质谱中观察到的高强度前体离子，增加了化合物定性的灵敏度和置信度。通过提高1-2个数量级的灵敏度，这种eISA技术可以使高分辨率质谱在全扫描模式下应用于低丰度代谢产物的直接定性和相对定量。
图2. 在Q-TOF DDA模式（20 eV）和eISA模式下获得的四种代谢物（正离子苯丙氨酸和色氨酸；负离子6-磷酸果糖和氧化型谷胱甘肽）的前体离子和相应碎片的绝对峰强比较。（Score: 比率得分。M.F.: 匹配因子。氧化型谷胱甘肽的9个碎片中此处只显示了6个。）
3 eISA与Q-TOF DIA模式的比较
与eISA类似，DIA模式不需要对一级质谱进行初始检测再触发二级质谱分析，所有离子都在碰撞池中碎裂，随之每个色谱峰会得到相应的DIA二级质谱图。在BRUKER impact II 型质谱仪中，DIA技术被称为广谱碰撞诱导解离（bbCID）。以上两种技术的工作流程分别如图3a和3b所示。
作者首先比较了模型分子在两种方法下得到的质谱图。将eISA模式下产生的碎片与DIA模式20eV下产生的二级质谱比对，计算比率得分。结果表明：负离子模式下，33个代谢物的两种谱图的碎片完全匹配（共50个）；而在正离子模式下， 16个代谢物的两种谱图的碎片完全匹配（共33个）。总的来说，与DIA模式相比，90%以上的分子在eISA的正负离子模式下至少能产生一半的对应碎片。随后作者计算了匹配因子来评估这两种质谱图的相似性。在负离子模式下，匹配因子的中位数为82%，且68%的分子的匹配因子超过60%；在正离子模式下，匹配因子的中位数为81%，且86%的分子的匹配因子超过60%（图3c）。这表明两种技术产生的碎裂谱图能很好地相互匹配。
为了探索eISA相对于DIA模式的优势，作者比较了两种方法下所有代谢物的前体离子和碎片的绝对强度。在eISA的负离子模式下，超过60%的前体离子的绝对强度得到增加，增加倍数的中位数为1.2倍；在正离子模式下，88%的前体离子的绝对强度得到增加，增加倍数的中位数为1.8倍（图3d）。这表明，与DIA模式下获得的离子相比，eISA模式生成的大多数前体离子具有相同或更高的强度。作者再次用前文的混标研究了两种模式下前体离子的灵敏度，结果eISA模式显示出与DIA相当或更高的灵敏度。这种在eISA模式下的灵敏度的提高可以用它独特的裂解机制来解释：一次DIA实验通常在限定的工作周期内进行，这可能限制了碰撞池中低丰度分析物的碎裂，而eISA在不受循环时间限制的情况下同时碎裂了每一个峰。就碎片绝对强度而言，在eISA负离子模式下92%的峰强比DIA高4.3倍；正离子模式下86%的峰强比DIA高4.6倍（图3e）。
总的来说，eISA模式没有像DIA模式那样将带有许多源内碎片的一级质谱提交到碰撞池进行二级质谱采集，而是生成了与DIA模式20 eV下相当的分子拟二级质谱。这项技术证明了eISA模式对所研究的分子具有相同或更高的前体离子灵敏度。
图3. eISA（a）和Q-TOF DIA（b）中的分子源内裂解和碰撞裂解。图c是不同离子化模式下eISA 和QTOF DIA各自匹配因子的垂直散点图。图d是不同离子化模式下eISA前体离子强度/Q-TOF DIA前体离子强度的比率，黑线代表中位数。图e是eISA 和Q-TOF DIA模式中碎片的绝对强度比率（中位数加95%置信区间）。Q-TOF DIA模式下的二级质谱图采集于20eV。
4 eISA用于非目标代谢组中代谢物的定性
为了说明eISA在非靶向代谢组学中的化合物定性能力，作者在高分辨率质谱（Q-TOF MS）增强源内裂解的条件下分析了小鼠巨噬细胞样细胞系（RAW264.7）的代谢物。eISA模式获得的一级质谱数据包含了样品中所有的分子离子及其碎片离子。表2为采用eISA得到正确定性的代谢物列表。在正负离子模式下共鉴定出13种化合物（表2）。在所研究的50个分子中，作者通过与METLIN中20 eV的二级质谱进行匹配，成功地根据比率分数和匹配因子确定了巨噬细胞提取物中41种代谢物的存在（表2）。eISA还定性出巨噬细胞提取物中存在列表以外的代谢产物，如衣康酸（表2）。定性结果通过标准品比对证实。
5 ESI单四级杆质谱上的eISA模式和化合物定性
小分子的ESI源内裂解碎片与二级质谱数据之间惊人的相似性，可能使在更简单的质谱平台（例如单四极杆质谱）上进行非目标性实验成为可能。为了验证这种可能性，作者使用液相-ESI单四极质谱仪在两个裂解电压下分析了50个分子的混标，裂解电压是调节源内裂解的关键参数之一。具有易碎结构的化合物（如氨基酸）通常在较低的电压下碎裂，而其他化合物（如脂类）则在较高的电压下碎裂，这可能会妨碍对易碎分子的前体离子的观察。为了补偿结构易碎性对裂解电压带来的可变影响，作者为那些需要低和高碰撞能量的化合物分别选择了两种裂解电压150V和300 V。总的来说，在50个分子（30个为正离子模式，36个为负离子模式）中有36个获得了与METLIN库中一致的碎片信息。当仅使用前体离子信息对分子定性时，METLIN库的命中数从1到305，中位数为34（n=66）。然而，当同时考虑到源内裂解信息时，命中数显著下降到与使用高分辨率质谱相当的水平（图4）。以上结果表明，eISA策略使得基于单四极杆质谱的非目标性液质联用数据更加有用。
值得注意的是，与以往研究中使用的Q-TOF质谱仪相比，ESI单四极杆质谱是一种灵敏度较低、动态范围有限的仪器。然而，与许多基于数据库的非目标性液质联用工作流程相似，可通过eISA识别的化合物仅限于METLIN数据库所包含的化合物。为了鉴定真正未知的化合物，仍然需要针对性的二级质谱分析，以产生可靠的二级质谱进行结构确认。此外，本研究仅采用了BRUKER impact II质谱仪和Agilent单四极杆质谱仪对eISA策略进行验证。
总结
液质联用方法中通常会最小化源内裂解。然而，本研究表明，增强源内裂解可用于提高一级质谱化合物定性的置信度。增强源内裂解可以在源内裂解片段中产生与METLIN中20 eV的二级质谱相似的碎片数量和碎片强度，从而允许直接和强健的代谢物定性，显著简化了代谢物的定性。METLIN目前拥有超过700000个化合物二级质谱，使得eISA有望成为一种自动化地稳健注释和定性广泛代谢物的方法。
与DDA和DIA方法相比，在eISA上前体离子的灵敏度比DDA高1-2个数量级，与DIA相同或更高。此外，eISA使ESI飞行时间质谱和四极杆（单级和三级）质谱上获得的一级数据更适用于分子定性。这表明eISA将使成千上万台目前仅用于一级质谱采集的四极杆仪器可用于非目标性液质联用实验，并且显著提高了注释的置信度。
评论
本文提出的eISA方法正是针对定性困难的科学问题提出的解决方案。
方法优势非常显著：
1. 提高了非目标分析的通量。eISA代表的源内裂解碎裂过程在ESI阶段即完成，而DDA代表的碰撞诱导裂解过程在第二个四级杆即碰撞池中才会发生。好比在一场考试中，eISA在进考场前已经完成了答题，而DDA还要等进场后发卷答题。不仅如此，DDA面对的试题不仅包括考卷上的试题（样品中的代谢物），还有邻座同学求助的小纸条（样品代谢物在源内裂解产生的附加碎片），而eISA只用答完试题，效率显然高于DDA。
2. 提高了前体离子的灵敏度。同上例，DDA在一场固定时间的考试中不仅需要答完试题还需要处理小纸条，那么分配给试题的时间和注意力显然不如在考前已经完成了试题的eISA多，质量显然落后。
3. 降低了非目标性分析的仪器成本。四级杆质谱仪因其平价和稳定在市场占有份额高于高成本的高分辨质谱，然而在非目标分析中高分辨质谱的数据不可或缺，若能使廉价的四级杆质谱达到和高分辨相当的数据置信度，显然能降低研究成本。
然而，eISA方法依然存在以下值得改进的地方：
1. 考察多品牌仪器普适性。如文内所说，eISA仅在BRUKER和Agilent的仪器上验证，若能在其他大众品牌如Thermo、Waters、Shimadzu、AB SCIEX得到验证,可能会得到更多关注和响应。
2. 数据库的普适性。对国内研究者而言，Metlin数据库的链接稳定性一直为人诟病。若能将该方法普适到其他开源数据库更便捷。
3. 真正的非目标性。如文内所说，eISA可识别的化合物仅限于METLIN数据库所包含的化合物。如何借助其他代谢组方法将其真正应用于非目标代谢组分析也十分值得思考。
4. 抗基质干扰能力。文中所选择的实际样品为细胞提取液，众所周知，细胞样品相对于血液、粪便、植物等样品而言成分简单干净，因此在质谱分析时基质效应的影响也会小很多。eISA在面对更为复杂的实际样品时是否还能保持定性的高置信度，也是值得关注的问题。
5. 峰归属问题。文中对于前体离子和对应的源内裂解碎片间的归属处理描述不多，而这一问题在目前热门的Thermo的DIA和AB SCIEX的SWATH（也是一种DIA）方案中是关键所在。如何做到尽量减少假阳性的归属碎片也是实现eISA准确定性需要回答的关键问题。
原文网址：https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00409