综述 | J. Proteome Res.：蛋白质S酰化的蛋白质组学分析
编译：微科盟子橘，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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蛋白质S酰化（通常称为棕榈酰化）是一种广泛的可逆脂质修饰，在调节蛋白质定位、活性、稳定性和复合物形成中起关键作用。蛋白质S酰化的失调会导致许多疾病，例如癌症和神经退行性疾病。在过去的十年中，蛋白质S-酰化的蛋白质组学分析取得了长足的进步，这大大提高了我们对S-酰化生物学的认识。在这篇综述中，我们总结了富集S-酰化蛋白质或肽段的技术，严格审查了蛋白质S-酰化在8个不同水平上的蛋白质组学研究，并提出了S酰化蛋白质组学领域的重大挑战。总之，蛋白质S酰化的蛋白质组规模分析已经成熟，并将在发现新的疾病机制，生物标记物和治疗靶标方面发挥越来越重要的作用。
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内容
1. 介绍
在真核细胞中，许多蛋白质会经历不同的脂质修饰，例如蛋白质S-酰化，肉豆蔻酰化，异戊烯基化和香叶基香叶酰化；其中，蛋白质S-酰化是可逆的脂质修饰，中长链脂肪酸共价通过不稳定的硫酯键与蛋白质的特定半胱氨酸残基连接。这也是在人类细胞中最常见的翻译后修饰之一，约4000个基因编码的蛋白质受到蛋白质S-酰化作用。蛋白S酰化可以通过不同类型的长链脂肪酸修饰S-酰化的蛋白质，例如棕榈酸酯（C16：0）、硬脂酸酯（C18：0）、肉豆蔻酸酯（C14：0）、棕榈油酸酯（C16：1）、油酸酯（C18：1）、花生四烯酸酯（C20：4）和二十碳五烯酸酯（C20：5）。因为棕榈酸酯是主要的脂肪酸，所以蛋白S酰化更常见，被称为蛋白S棕榈酸酯化或简称为棕榈酰化。
蛋白质S酰化的首次报道是在1979年。在经过一个停滞的十年之后，人们在随后的三十年见证了S酰化相关报道的稳定增长，这表明人们日益认识到蛋白质S酰化的功能重要性。研究表明，可逆蛋白S-酰化可动态调节蛋白的定位，活性，稳定性，运输和复杂形成。在细胞中，蛋白s酰化的可逆性为介导膜蛋白在亚细胞细胞器之间的快速运输，以及调节蛋白在脂筏等膜室中的分离或聚集提供了重要的机制。此外，S酰化作用可能与其他翻译后修饰（PTM）发生相互作用以形成动态的调节程序，例如S-亚硝基化、泛素化和磷酸化。因此，蛋白S酰化在诸如细胞信号传导、代谢、免疫反应和宿主-病原体相互作用等广泛的生物过程中起着关键作用，其畸变导致许多疾病，包括癌症和神经退行性疾病疾病。
在真核生物中，蛋白质s-酰化可以是自发的，但它被认为主要是由一组高度保守的含有Asp-His-His-Cys (DHHC)基序的棕榈酰s-酰转移酶(PATs)催化的，该酶由ZDHHC基因编码。不同的物种有不同数量的DHHC-PATs:酵母中有5-7个，拟南芥中有24个，哺乳动物中有23-24个。在人类细胞中，除ZDHHC10外，有23个PATs由基因ZDHHC1-24编码，所有这些PATs都是完整的膜蛋白，具有一系列的细胞定位和组织表达模式，大多数PATs定位于内质网(ER)和高尔基体，至少3个PATs (DHHC-5/20/21)主要定位于质膜。蛋白质的S-酰化是可逆的，去S-酰化是由酶催化的，如酰基蛋白硫酯酶(APTs)，棕榈酰蛋白硫酯酶(PPTs)，和α/β水解酶折叠结构域(ABHD)蛋白，这些酶定位于不同的亚细胞位点，如细胞溶胶(APT1/2和ABHD17A/B/C)、溶酶体(PPT1/2)和线粒体(ABHD10)，为了方便起见，所有这些去S酰化酶以下称为APTs。
研究表明，DHHC-PAT催化S-酰化通常分两步进行:DHHC-PAT自酰化形成短暂的酰化中间体，然后脂肪酰基从DHHC基序近距离转移到其底物蛋白上(图1A)。大多数DHHC-PATs能够在没有蛋白辅助因子的情况下催化S-酰化；然而，一些DHHC-PAT的正常功能需要辅助因子，这些酶和辅助因子形成蛋白复合物，如Erf2-Erf4,DHHC5-GOLGA7,DHHC6-SELENOK(SelenoproteinK)，DHHC9-GCP16 (16kda的高尔基复合体相关蛋白)，这些辅助因子可以稳定同源DHHC-PATs或酰基DHHC中间体。在蛋白质去S-酰化过程中，APTs可以被s-酰化并栓系到膜上，在那里它们去除底物蛋白的S-酰基(图1B)。
图1 蛋白质S-酰化和去S-酰化的生物化学
(A)DHHC-PATS是一种完整的膜蛋白，其活性位点指向胞质。DHHC-PAT首先在DHHC半胱氨酸残基上自酰化，然后将S-酰基转移到底物蛋白的受体半胱氨酸残基上。某些DHHC-PAT需要辅助因子才能正常运作。(B)脱S-酰化酶可以去除底物S-酰蛋白上的S-酰基。去S-酰化酶的一个亚群被S-酰化并栓在膜上，它们的疏水袋捕获底物S-酰化蛋白的S-酰链，允许酶去S-酰化。
研究者使用[3H]-棕榈酸酯标记对蛋白质S-酰化进行分析，然后进行免疫沉淀和胶片暴露数天至数周，然而，这种方法只允许在单个蛋白质的基础上分析S-酰化，而且这有风险、费时，而且有时灵敏度不够。为了促进S-酰化蛋白的检测和定量，自2004年以来，科研人员已开发出多种富集S-酰化蛋白/肽的方法，这些方法与基于质谱的蛋白质组学方法结合，用于S-酰化蛋白的整体鉴定和定量蛋白质和S-酰化位点。这篇综述旨在总结这些方面的进展，并提供我们对S-酰化蛋白质组学领域的主要挑战的看法。对于蛋白质S-酰化酶及其在病理生理中的功能的综述，读者可参考参考文献(PMID:29602512;29999430;30232163)。
2. S-酰化蛋白质的富集方法
对于蛋白质S酰化的蛋白质组规模分析，关键步骤是富集具有高特异性的S酰化蛋白。自2004年以来，研究者已开发出各种方法来富集S-酰化的蛋白质。这些方法可大致分为两类：一类称为酰基-生物素交换（ABE），另一种是用棕榈酸类似物随后进行点击化学（MLCC）的代谢标记（图2）。
图2 富集S酰化蛋白的方法示意图
(A)在酰基-生物素交换(ABE)中，半胱氨酸上的游离硫醇被烷基化试剂(显示为蓝色五边形)阻断。S-酰基被中性的羟胺切断，新暴露的游离硫醇被生物素标记(显示为紫色的双五边形)。生物素标记(以前的S-酰化)蛋白通过链霉亲和素亲和纯化捕获，用还原剂洗脱，并通过LC-MS/MS分析。(B)用棕榈酸类似物进行代谢标记，然后用点击化学(MLCC)，炔或叠氮(绿色三键)功能化棕榈酸类似物通过内源性的S-酰化机制并入S-酰化位点。细胞裂解后，棕榈酸类似物标记(即S-酰化)的蛋白质通过点击化学与生物素类似物结合(显示为黄色的双五角形)(三唑类化合物显示为绿色的三角形)，通过链霉亲和素亲和纯化选择性富集，并通过珠状胰蛋白酶消化。
2.1 与ABE相关的方法
ABE是一种以半胱氨酸为中心的方法（图2A）。在ABE中，游离的半胱氨酸残基被烷基化试剂封闭，然后S-酰化的半胱氨酸残基被中性羟胺转化为游离的半胱氨酸残基，后者特异性裂解硫酯键，通过半胱氨酸烷基化将新形成的游离半胱氨酸残基（即，以前是S-酰化的半胱氨酸残基）与生物素类似物（例如，生物素-HPDP）缀合，因此，S-酰化的蛋白质被转化为生物素化的蛋白质，它们可以通过链霉亲和素亲和纯化来富集。
Green的团队于2004年报道了第一种ABE方法，尽管如此，该方法仅与链霉亲和素印迹法结合使用以定量单个蛋白质α7/5HT3A。Davis实验室于2006年首次报道了基于ABE的S-酰基糖组学研究，在这项研究中，游离的半胱氨酸残基被N-乙基马来酰亚胺（NEM）阻断，在羟胺处理之后，使新形成的游离硫醇与生物素-HPDP反应，并且通过链霉亲和素亲和纯化来富集体外生物素化的蛋白质（即，以前为S-酰化的蛋白质）；随后，他们开发了各种与ABE相关的S-旋体方法，以进行位点特异性分析，简化程序并进一步提高特异性（图2A）。
为了进行特定于位点的S旋度分析，至少开发了六种不同的方法。2008年，Zhang等人报道了一种称为棕榈酰-半胱氨酸分离捕获和分析（PICA）的方法。在PICA中，游离的半胱氨酸残基被甲硫代磺酸甲酯（MMTS）阻断，然后用中性羟胺裂解硫酯键；随后，新形成的硫醇用可裂解的同位素编码的亲和标签（cICAT）标记；蛋白质消化后，他们将cICAT标记的胰蛋白酶肽在亲和素亲和柱上纯化，然后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定。在2010年，我们发布了另一种方法，称为棕榈酰蛋白鉴定和位点表征（PalmPISC）。在PalmPISC中，二硫键被三（2-羧乙基）膦（TCEP）还原，所有游离硫醇都被NEM烷基化；随后，S-酰基被中性羟胺裂解，并且新形成的硫醇与生物素-HPDP缀合；蛋白质消化后，通过链霉亲和素亲和纯化富集体外生物素化的肽（即以前的S-酰化肽），并通过LC-MS/MS分析肽的鉴定和位点定位。在2011年，Forrester等人开发了一种称为酰基树脂辅助捕获（acyl-RAC）的方法，该方法通过MMTS阻断游离的半胱氨酸残基，然后进行羟胺处理以裂解S-酰基；随后，他们用硫醇反应性硫丙基丙基琼脂糖树脂捕获新形成的游离硫醇，将捕获的蛋白质进行树脂消化，然后洗涤以除去非S-酰化的肽；之后，剩余的S-酰化肽由二硫苏糖醇释放并通过LC-MS/MS分析。在2015年，Gould等人开发了一种类似于酰基RAC的方法，其中使用苯汞树脂替代了硫丙基琼脂糖树脂。2017年，Collins报道了另一种称为定点ABE（ssABE）的方法，碘乙酰胺使游离的半胱氨酸残基烷基化，中性羟胺去除S-酰基，生物素-HPDP标记新形成的半胱氨酸残基，胰蛋白酶消化蛋白质，链霉亲和素琼脂糖富集以前的S-酰化肽。在2019年，Zareba-Koziol发布了一种名为PANIMoni的方法，代表了棕榈酰化和亚硝基化相互作用的监测。PANIMoni方法从本质上扩展了我们的PalmPISC方法，以分析S-酰化和S-亚硝基化。这六种方法依赖于体外化学反应和蛋白质消化来捕获最初被S-酰化的肽，然后进行LC-MS/MS分析以进行肽鉴定和位点定位。
ABE富集耗时且劳动强度大，需要多轮蛋白质沉淀和溶解才能去除多余的化学试剂，因此它们不会干扰后续反应。为了简化程序，研究者们进行了多项改进。Hurst等人的结果表明，在水性Diels-Alder 4 + 2环加成反应中，2,3-二甲基-1,3-丁二烯可以清除NEM，因此，可以消除用于去除过量NEM的多个沉淀步骤，上述ssABE方法使用分子量截断值为30kD的Amicon Ultra旋转过滤柱进行缓冲液交换，经过至少10次冗长的离心旋转；但是，它消除了多个沉淀增溶循环，因此劳动强度较低。前述的酰基-RAC方法用一步硫丙基丙基琼脂糖反应代替了两步生物素化和链霉亲和素亲和纯化，产生了一种用2,2'-二硫代二吡啶（Fe3O4/SiO2-SSPy微球）修饰的新型磁性微球，它可以与中性羟胺暴露的游离（以前是S-酰化的）半胱氨酸残基直接反应，类似于酰基-RAC方法中的硫丙基琼脂糖。
然而，由于非S-酰化形式的共分离，ABE方法总是遭受高背景的困扰。定量蛋白质组学分析显示，ABE富集的蛋白质中约有三分之二是背景蛋白质。高本底可能会严重掩盖低丰度S-酰化蛋白的检测，并压缩许多S-酰化蛋白的信噪比。为了解决此问题，我们开发了一种名为低背景ABE（LB-ABE）的新方法。我们发现，即使经过较长的孵育时间，某些非S酰化的半胱氨酸残基也无法被NEM完全阻断。残留的游离半胱氨酸残基可与生物素-HPDP反应，导致其体外生物素化，因此，可以通过链霉亲和素亲和纯化将一部分非S-酰化的蛋白质，特别是含有多个非S-酰化的半胱氨酸残基的蛋白质与S-酰化的蛋白质共分离。通过使用2,2'-二硫代二吡啶（DTDP）（一种类似于HPDP的硫醇反应试剂），可以进一步封闭残留的半胱氨酸，从而防止它们被生物素-HPDP生物素化并通过亲和纯化富集。使用LB-ABE方法，共分离的背景蛋白水平降低了70％以上。值得注意的是，通过将LB-ABE方法与LC-MS/MS结合使用，我们从人前列腺中鉴定出2,895个高可信度候选S-酰化蛋白癌细胞LNCaP。
2.2 MLCC相关方法
MLCC是一种以棕榈酸酯为中心的方法（图2B）。在MLCC中，叠氮化物或炔基官能化的棕榈酸酯类似物在细胞培养过程中被代谢掺入S-酰化的蛋白质中。细胞裂解后，研究者通过点击化学将棕榈酸酯类似物标记的蛋白质与生物素类似物偶联，可以通过抗生蛋白链菌素亲和纯化分离体外生物素化的（以前是S-酰化的）蛋白质。
Ploegh小组于2007年报道了第一种MLCC方法，但是，与第一种ABE方法相似，MLCC方法仅能与链霉亲和素印迹法结合使用来检测脂肪酰化的蛋白质。一年后，Berthiaume实验室发表了第一个基于MLCC的S旋盖体分析，在这项研究中，他们将ω-叠氮基-棕榈酸酯代谢整合到线粒体蛋白中，并通过Staudinger连接方法将标记的蛋白与膦-生物素偶联，然后进行MS分析。随后，他们开发了许多MLCC衍生的方法（图2B）。主要区别包括（1）不同的棕榈酸酯类似物，例如叠氮棕榈酸酯，棕榈酸炔基酯（Alk-C16）和硬脂酸炔基酯（Alk-C18，也称为17-十八烷基酸或17-ODYA），（2）不同的亲和标签，例如膦-生物素和生物素-叠氮化物，以及（3）不同的偶联方法，例如点击化学（叠氮化物-炔）和施陶丁格连接法（叠氮化物-膦）。有关MLCC的全面概述，请参见参考(PMID: 29290622)。
2.3 ABE和MLCC是高度互补的
ABE和MLCC是具有不同优缺点的互补方法。首先，ABE可用于分析所有类型的生物样品（包括临床组织和生物流体）中的蛋白质S-酰化，而MLCC不适用于MLCC，因为它需要进行代谢标记；其次，ABE和MLCC均可应用于体外培养的细胞；然而，MLCC通常需要优化棕榈酸酯类似物的浓度和代谢标记时间，以实现最佳的敏感性并使细胞死亡最小化；此外，MLCC不太适合具有高脂肪生成活性的细胞（例如，许多癌细胞系），其中S-酰化蛋白主要由天然棕榈酸酯标记，而ABE可以均匀地应用于任何细胞类型；第三，ABE有潜力发现整个S-酰化的蛋白质组，而MLCC倾向于快速转换的S-酰基蛋白。
第四，ABE实现了S酰化的全球特定地点分析，但是，它无法区分不同的硫酯连接的修饰，这些修饰在样品处理过程中被中性羟胺去除。相反，MLCC尚未成功应用于全面分析S-酰化位点，这主要是因为MLCC方法引入了非常疏水的庞大（400-900Da）基团，因此，标记的S-酰化肽很容易在样品制备、转移和存储过程中丢失，它们也很难在Ci8反相色谱柱上分离；第五，MLCC允许研究S-酰化动力学，由于S-酰基的去除，ABE不太适合于此；第六，MLCC可能允许S-酰化的活细胞成像，而ABE很难做到；最后，ABE不能区分不同的S-酰基种类或不同的硫酯连接修饰（图3A），而MLCC可以检测到除S-酰化以外的N-或O-酰化（图3B），例如，研究者们已经证明TNFα可以在K19和K20残基上长链脂肪酰化，因此它可以被MLCC检测或富集，但为了区分S-酰化与其他脂肪酰化，需要进行羟胺处理（图3B）。总之，ABE和MLCC是高度互补的，最好结合使用。
图3 说明ABE或MLCC可以检测到翻译后修饰
(A)ABE无法区分的有代表性的硫酯连接PTMS。硫酯键用红色表示。(B)MLCC可以检测到的具有代表性的脂肪酰化(S-酰化和N-酰化)。羟胺处理可以区分S-酰化和N-酰化。
3.蛋白质S-酰化的蛋白质组学分析
由于缺乏S-酰基蛋白特异性抗体，因此研究者们仅通过ABE/MLCC富集，然后进行MS分析来进行S-酰基蛋白质组学研究，这些研究大致可分为八类：
1)定性的S-酰基蛋白质组学，用于鉴定S-酰基蛋白和S-酰基化位点;
2)比较S-酰基蛋白质组学，比较两种不同的S-酰基蛋白质组;
3)时间S-酰化蛋白质组学，研究S-酰化动力学;
4)S -酰化与其他蛋白修饰之间的关联分析;
5)S酰化蛋白复合物的蛋白质组学鉴定，
6)PAT/APT基板的全局识别;
7)PAT/ APT绑定伙伴的全局识别
8)PAT/APT抑制剂脱靶蛋白组学鉴定(图4)。
如图5所示，早期的S-旋体组学研究以定性S-旋体组学分析为主导，而近年来，更多的功能性S-旋体组学研究得到了证实。
图4 S-酰化研究中不同类型蛋白质组学应用的插图
（A）定性S-酰基蛋白质组学侧重于分析S-酰基蛋白和S-酰基化位点，并将它们与共分离的非S-酰基化形式区分开。（B）比较S-酰基组学比较了在不同条件下S-酰基蛋白质组之间的差异。（C）时间S-酰基脂质组学研究了蛋白质S-酰基化在不同时间点的动态变化。（D）S-酰化与其他PTM之间相互作用的蛋白质组学分析。（E）对S-酰化的蛋白质复合物的蛋白质组学分析鉴定了与靶蛋白的S-酰化形式相关的蛋白质。（F）通过鉴定其S-酰化水平受特定PAT/APT调节的蛋白质，对PAT/APT底物进行蛋白质组学分析。（G）PAT/APT结合伴侣的蛋白质组学分析。（H）蛋白质组学鉴定PAT/APT抑制剂的脱靶位。
3.1 定性S-旋体组学
目前，ABE和MLCC都不能将S-酰化的蛋白质富集到100％的纯度；另外，到目前为止，研究者们还没有建立用于蛋白质组规模鉴定完整的S-酰化肽的技术，因此，在候选S-酰化蛋白和S-酰化位点的蛋白质组学鉴定中，必须包括适当的对照，以从鉴定的总蛋白列表中排除共分离的非S-酰化蛋白。为了区分推定的S-酰基蛋白和共分离的污染物蛋白，研究者们至少需要进行半定量蛋白质组比较，然后进行统计分析。
在过去的14年中，共有40篇S-酰基蛋白质组学论文，对不同物种(特别是人类(14篇)和小鼠(13篇)的S-酰基蛋白进行了分类，鉴定出的候选S-酰基蛋白数量逐渐增加。然而，应该指出的是，这些研究中的许多都没有进行统计分析或严格的有效截止值以过滤出共分离的非S-酰化蛋白，因此，对于某些要求保护的候选S-酰基蛋白的有效性，研究者需要格外小心。然而，随着更先进的S-酰基蛋白质组学技术的发展，即使采用严格的临界值，单项研究也报道了数百至数千种假定的S-酰基蛋白。例如，使用LB-ABE和无标签蛋白质组学，作者的实验室从培养的人类LNCaP细胞中鉴定出近3000个假定的s -酰基蛋白，严格限定FDR<1%，富集倍数为>2。值得注意的是，根据SwissPalm数据库(v3)汇编的2019年6月28日之前发表的近800项S-酰化研究中，约3600个人类和约3800个小鼠基因可能编码S-酰化蛋白(图6)。这表明蛋白质S-酰化是一种普遍的PTM，整个S-酰基蛋白质组可以在不久的将来通过单个研究进行定位。
S-酰基蛋白可包含一个和多个S-酰化的半胱氨酸残基；然而，尽管研究表明S-酰化通常在接近蛋白质N/C末端的半胱氨酸残基上、富含半胱氨酸的基序内或与胞质相邻的半胱氨酸残基上建立，但其尚未建立S-酰化的共有位点。最近的一项研究表明，膜蛋白S酰化是由膜蛋白上的半胱氨酸与PAT的可及性决定的，而不是首选的底物序列基序。尽管研究者们已经开发了计算算法来预测S-酰化站点，其可靠性仍不确定，因此，需要进行S-酰化位点的实验鉴定。迄今为止，研究者们已经进行了六次针对特定部位的S-酰基代谢组学研究，以确定新的S-酰基化部位。如上所述，由于与高疏水性相关的技术挑战，MLCC不适用于特定地点的分析，所有这些位点特异性研究都采用了ABE相关方法来富集最初的S-酰化肽；然而，其中只有三个包含了对照组，并从所有确定的位点中过滤出背景非S-酰化位点。在一项研究中，我们应用PalmPISC分析了人类DU145细胞的脂筏和非脂筏部分，并鉴定了127个假设的S-酰化位点，高度可信(p<0.05，>2.4倍)和39个S-酰化位点，中度可信(p<0.095，>2倍)。在另一项研究中，Fang等人应用酰基-RAC分析人类SW480细胞，鉴定出151个假定的S-酰化位点(>2倍富集)。此外，Collins等人应用ssABE分析小鼠前脑，确认了906个假定的s -酰化位点(FDR<0.05，>3倍富集)。考虑到>3500个人类/小鼠基因编码S-酰化蛋白，并且许多S-酰化蛋白可能包含两个或更多的S-酰化位点，预计一个S-酰化蛋白组可能包含> 5000个S-酰化位点。因此，更强大的技术仍有待开发，以覆盖完整的S-酰基蛋白质组在位点特异性水平。
3.2 比较S-旋体组学
自2011年以来，研究者们进行了16项S-酰基蛋白质组学比较研究，以鉴定在两种条件下差异表达的S-酰基蛋白，ABE和MLCC方法都已成功应用于这些研究中。为了进行定量比较，研究者们最常用的技术是无标记定量（LFQ；6个研究中），然后用细胞培养物中的氨基酸进行双链稳定同位素标记（SILAC2plex；4个研究中），而比较性S-酰基蛋白质组学研究几乎只针对人类或小鼠样品（每个物种8个研究）。
在这些比较的S-酰基蛋白质组学研究中，我们和合作者使用LB-ABE结合无标记蛋白质组学进行了最全面的研究。在一项研究中，我们比较了全细胞裂解液、膜组分、细胞外小细胞的S-酰基蛋白质组学，从人PC3细胞中分离出的囊泡（EV）和大型EV中共鉴定出2408种假定的S酰基蛋白，其中四类中141种S酰基蛋白高度丰富，而388种S酰基蛋白的丰度却不同，而这项研究报告了EV的第一个S-酰基蛋白特征，并证明了大小EV都带有与不同生物过程和亚细胞起源相关的蛋白质。在另一项研究中，我们比较了（1）顺铂敏感的T24S与顺铂耐药的T24R膀胱癌细胞，（2）用或不用2-溴棕榈酸（2BP），一般的S-酰化抑制剂处理的T24S细胞的S-酰基蛋白质组，以及（3）使用2BP和不使用2BP处理的T24R细胞。总的来说，研究鉴定了3695个假定的s -酰基蛋白，其中200-500个在每次比较中有差异表达。有趣的是，与T24S细胞相比，免疫检查点蛋白PD-L1在T24R细胞中高度S酰化；此外，脂肪酸合成酶的药理抑制抑制了PD-L1的S-酰化和丰度。因此，研究结果强调了蛋白S-酰化在介导膀胱癌化疗耐药中的作用。综上所述，这两项研究证明了我们基于LB-ABE的S-酰基蛋白质组学方法综合比较S-酰基蛋白质组的有效性。
3.3 动态S-酰化
迄今为止，只有一项s -酰基蛋白质组学研究用于检测s -酰基蛋白的时间变化。在本研究中，Won和Martin将MLCC与6-plex串联质量标签结合，分析了人293T和HAP1细胞S-酰基蛋白组的变化。用或不用十六烷基氟膦酸盐(一种丝氨酸脂肪酶抑制剂)处理这些细胞45、90、180、360和480分钟。无监督层次聚类分析显示了四种具有不同动力学特征的聚类。值得注意的是，循环最迅速的s -棕榈酰化簇包括特征明确的信号蛋白，如NRAS、MTDH和GNAS。随着TMT试剂可用于16-plex和27-plex分析，我们预计在不久的将来将开展更多动态s -酰化蛋白质组学研究，以更好地理解动态S-酰化在细胞信号转导和发病机制中的作用。
3.4 S-酰化与其他PTM之间的相互作用
研究者们进行了两项蛋白质组学研究，以分析蛋白质S-酰化与其他半胱氨酸修饰之间的联系。在一项研究中，Gould等人全面鉴定了小鼠肝中经过S-酰化，S-谷胱甘肽化，S-亚硝基化和S-亚磺酰化修饰的半胱氨酸残基。在1319个小鼠肝脏蛋白中共绘制了2596个位点。研究表明，这四种半胱氨酸修饰在很大程度上是互斥的——它们针对离散的蛋白群和半胱氨酸残基，修饰之间的互补很小；然而，应该注意的是，这里没有对照样品被纳入来区分修饰肽和含有半胱氨酸残基的共富集未修饰肽。因此，目前尚不清楚真正识别出多少个已识别位点。在另一项研究中，Zeraba-Koziol等研究人员开发了一种称为PANIMoni的方法，以研究慢性应激小鼠模型中突触后密度蛋白的S-酰化和S-亚硝基化的联系，他们分别从465个和360个蛋白中鉴定出总共813个S-酰化的和620个S-亚硝酰化的半胱氨酸位点。这项研究与Gould等人的上述结论有些矛盾，它表明，这两种修饰可能会影响122种蛋白质的调节，包括受体，支架蛋白，调节蛋白和细胞骨架蛋白。研究表明，尽管S-酰化和其他半胱氨酸修饰之间的互相影响并不广泛，但确实发生在某些功能重要的蛋白质上。
另外，许多研究表明，对于某些蛋白质而言，S-酰化作用阻止蛋白质的泛素化和降解。我们和其他人的S-酰基磷酸组学研究还表明，许多激酶和磷酸酶可以被S-酰基化，因此，如何确定s-酰化与泛素化或磷酸化之间是否存在广泛的交叉作用，以及这种交叉作用的生物学功能将是一个很有意义的问题，为了解决这些问题，需要开发更灵敏的方法，因为这些修饰的化学计量一般较低。
3.5 S-酰化蛋白复合物的蛋白质组学分析
研究表明，蛋白质S-酰化作用可调节蛋白质复合物的形成，因此，要了解蛋白质S-酰化的功能，最关键的是将S-酰化的蛋白质与未修饰形式的结合伴侣区分开。但是，与细胞溶质蛋白复合物相比，分析与膜相关的S-酰化蛋白复合物更具挑战性，因为前者通常在细胞裂解过程中被破坏并且难以在体外重构。为了解决这个问题，Peng和Hang开发了一种双功能脂肪酸化学报告分子x-alk-16，用于表征活细胞中S-棕榈酰化的蛋白质复合物，本报告配备了用于双正交检测S-棕榈酰化蛋白的炔烃，以及用于S-棕榈酰化蛋白复合物细胞内光交联的二嗪。在这项研究中，为表征S-酰化的IFITM3蛋白复合物，研究者在带有或不带有x-alk-16标记的HEK293T细胞中过表达HA标记的IFITM3，然后在365nm处使用或不使用紫外线进行照射；细胞裂解后，他们通过抗HA免疫沉淀富集IFITM3蛋白复合物。通过对光交联组和非光交联组的无标记蛋白组学比较，鉴定出12种假定与IFITM3相互作用的蛋白，其中CANX和BCAP31得到了进一步证实。尽管前景看好，但x-alk-16似乎还没有商业化，阻碍了其他研究小组的采用。
3.6 PAT/APT底物的S旋流鉴定
要了解PATS/APT在生理和疾病中的生物学功能，必须重建PAT/APT-底物网络。到目前为止，大多数PAT/APT-底物对都是基于单个蛋白质建立的，主要是通过位点诱变。我们对SwissPalm数据库和文献的调查表明，每个PAT/APT都已映射了0-40个蛋白底物（图7），而鉴定出的PAT底物在人中强烈偏向DHHC2/3/5/7/17，在小鼠中偏向DHHC3/7/13/17（图7A-B）。这可能是因为这些PATs在主要疾病如亨廷顿氏病(DHHC13/17)、I型糖尿病(DHHC17)和癌症(DHHC2/3/5/7/13/17)中的功能重要性吸引了许多群体。相比之下，除了APT1外，我们对每个APT的底物知之甚少(图7C-D)。
为了促进新型PAT/APT底物对的发现，研究人员已应用定量或半定量S-酰基蛋白质组学方法比较野生型和PAT/APT缺陷细胞或组织中S-酰基蛋白质组的差异。迄今为止，已经报道了总共15项S-脂蛋白组学研究，以确定人DHHC2、DHHC3和APT1，小鼠DHHC5/7/13/17和APT1，果蝇DHHC8，植物TIP1，真菌AkrA以及酵母Ark1/2，Erf2，Swf1和Pfa3/4/5，其中12项研究采用了与ABE相关的方法，这可能是因为它们的适用性比MLCC更广泛，而基于S酰基蛋白质丰度的显着变化，每个研究最多鉴定出362种候选底物蛋白。
但是，应该注意的是，PAT/APT的遗传操作可能会导致蛋白质丰度发生重大变化，从而导致错误发现候选底物。因此，需要将定量蛋白质组学分析与定量S-酰基蛋白质组学分析同时进行，以最大程度地减少错误发现，但在15项研究中，也只有2项进行了定量蛋白质组学分析。在一项研究中，研究人员应用MLCC来富集来自对照和Zdhhc5缺陷小鼠的神经干细胞中的S酰化蛋白，并使用SILAC定量S酰基蛋白质组差异。与对照细胞相比，在Zdhhc5缺陷型细胞中，约300种候选S-酰基蛋白中约有20种减少>2倍。但是，对未配对样品的胰蛋白酶消化物的蛋白质组学分析表明，S-酰基蛋白水平的变化实际上反映了总体膜蛋白丰度的差异，因此，尚不清楚所鉴定的候选DHHC5底物中哪些是真实底物或错误发现。在另一项研究中，Shen等应用酰基RAC富集野生型和Zdhhc13缺陷型小鼠肝脏中的S-酰化肽，共鉴定出1,905个S-酰化位点，对应于883个蛋白质。他们使用LFQ，鉴定了许多差异丰富的S-酰化肽，但是该数目未在本文中指定，另外，他们对配对样品进行了基于TMT10plex的定量蛋白质组学比较，以消除蛋白质表达变化的影响，因此，对应于254种蛋白质的400个S-酰化位点被接受为候选DHHC13底物位点，其中，MCAT的Cys104和CTNND1的Cys618被确认为DHHC13底物位点，其余13项研究未同时进行定量蛋白质组学分析；然而，在一些研究中，少数候选底物已通过正交方法成功验证。综上所述，单独的定量S-酰基组学分析可提供有用的信息，以鉴定潜在的酶底物，但要以免数据过度解释。
总之，整合的定量S-酰基组学和蛋白质组学分析具有大规模发现PAT/APT-底物网络的巨大潜力，因为哺乳动物基因组编码>30个PAT/APT和>3,500个S-酰化蛋白，到目前为止，科研人员仅绘制了整个网络的冰山一角。在S-酰化领域需要集体的努力来探索未知领域，这将为S-酰化生物学提供深刻的见解，并揭示新的疾病生物标记物和治疗靶标。
3.7 PAT/APT结合伴侣的蛋白质组学鉴定
越来越多的证据表明，类似于MAPK信号级联反应，PAT可以通过激活S-酰化级联反应来调节间接底物的S-酰化水平。DHHC16可以使DHHC6S-酰化，从而调节其周转、定位和活性，因此，为了重建PAT/APT底物网络，区分每种酶的直接底物和间接底物很重要，但是，这不能通过上面提到的整合式S-酰化蛋白质组学和蛋白质组学分析来实现。为了鉴定直接底物，研究者提出一种策略——使所有候选底物与每种PAT/APT的结合伴侣重叠；另外，PAT/APT可以发挥非酶功能，例如用作支架蛋白，因此，PAT/APT结合伴侣的识别对于理解非酶功能同样重要。
迄今为止，研究人员进行了五项蛋白质组学研究，以鉴定人/小鼠PAT/APT的结合伴侣，其中有两项研究专注于发现DHHC5相关蛋白，在一项研究中，Wang等人应用BioID来鉴定小鼠3T3-L1细胞中DHHC5的近端蛋白，从而鉴定出10种与DHHC5相关的蛋白，包括CD36；在另一项研究中，Woodley等人利用亲和纯化-质谱(AP-MS)鉴定了人类HeLa细胞中DHHC5结合伙伴，分别鉴定了质膜和核内体中的304和39个候选相互作用蛋白，令人惊讶的是，这两项研究没有发现任何与DHHC5结合的共同伴侣。另外两项研究分析了与PPT1结合的伙伴。在一项研究中，Scifo等人和Sapir等人使用AP-MS分析人SH-SY5Y细胞中的人PPT1相互作用基因组，从而鉴定出22种候选PPT1相互作用蛋白，而我们使用AP-MS研究了小鼠脑中PPT1的相互作用基因组，从而鉴定出了64种与PPT1相互作用的候选蛋白。然而，两项研究仅鉴定出一种蛋白（VCP）。综上所述， PAT/APT可能在不同物种或细胞类型中形成不同的复合物。
最近，Luck等人发布迄今为止最大的人类参考相互作用组（HuRI）图谱，报告了8,274种人类蛋白之间的52,569种相互作用。根据最新的HuRI在线数据库，研究者发现DHHC15有53种相互作用蛋白，其次是11种其他PAT和两个APT（图8），但是，当前版本尚未涵盖DHHC5或PPT1相互作用基因组。我们期望在不久的将来将报告更全面的PAT/APT相互作用组。
3.8.蛋白质组学鉴定PAT/APT抑制剂脱靶
由于蛋白质S-酰化在生理和疾病中的重要作用，研究者们已经开发了多种PAT/APT抑制剂来研究S-酰化的功能，而为了评估抑制剂的选择性并预测体内可能发生的不良事件，分析每种抑制剂的脱靶目标非常重要。
尽管人们做出了许多努力，但尚未成功开发出用于各个PAT的抑制剂，但是研究者发现，蛋白S酰化可被基于脂质的抑制剂（如2-溴棕榈酸酯（2BP））和基于非脂质的抑制剂（如cerulenin和衣霉素）广泛抑制。为了确定2BP的脱靶目标，科研人员开发了两种类似于MLCC的方法，在其中一种方法中，他们合成了2BP的ω-叠氮基类似物（2BPN3），用于代谢标记，点击缀合和链霉亲和素富集潜在2BP靶标，发现大约有450个推定的靶标高度富集（相对于对照而言，≥5倍），其中只有五个是DHHC-PAT；而在另一种方法中，研究人员合成了2BP的两个末端炔烃类似物16C-BYA和18C-BYS，以标记和富集2BP靶标，从而鉴定出1200多种蛋白质，包括三个DHHC-PAT；他们同样也发现铜蓝蛋白靶向包括DHHC20在内的140蛋白。总体而言，研究表明，尽管2BP和铜蓝蛋白确实靶向某些DHHC-PAT，但它们都具有大量脱靶位，因此，研究人员们还在等待更有效和具有特异性的PAT抑制剂。
对于APT，研究者们已经成功开发了几种小分子抑制剂，例如APT1/2抑制剂Palmostatin B/M，APT1特异性抑制剂ML348和APT2特异性抑制剂ML349。要确定Palmostatin B/M的脱靶目标，Rusch等人设计并合成了两种基于Palmostatin B/M的基于活性的蛋白质组图谱（ABPP）探针，并将其应用于SDS-PAGE凝胶中的探针靶标，切除了差异丰富的凝胶带，并通过LC-MS/MS鉴定了蛋白质，他们总共鉴定出59种蛋白质，包括APT1/2和PPT1。为了确定ML349目标，Won等人合成了生物素化的ML349，并将其用于富集ML349相互作用蛋白；此外，他们还将o-ML349-生物素和未结合的叠氮化物-PEG3-生物素（它们对APT2的抑制活性都非常低）用作阴性对照。无标记蛋白质组学分析确定了包括APT2在内的大约10个候选ML349目标。综上所述，研究表明APT抑制剂是相对目标特异性的，但仍然有一些脱靶现象。
4.S-旋体组学的重要挑战
4.1 天然和完整的S-酰化肽的全局分析
当前，研究人员仍然缺乏有效的方法来对天然和完整的S-酰化肽进行全局分析，S-酰化蛋白质组学领域仍需探究，而ABE和MLCC都无法解决此问题，因为前者会去除脂肪S-酰基，而后者会利用非天然脂肪酸。这里存在的挑战至少有两个方面：首先，尚未开发出将天然S-酰化肽与所有其他非S-酰化肽有效分离的方法，尽管有文章报道了泛抗棕榈酰化抗体，但尚不清楚它是否能有效地富集S-棕榈酰化肽；其次，由于它们的高疏水性，完整的S-酰化肽倾向于在样品处理过程中丢失，并且难以通过常规C18反相色谱柱分离，因此，需要开发突破性的技术来应对这两个挑战。
4.2 S-酰化位点化学计量的蛋白质组学分析
我们的实验室和其他实验室已经证明，蛋白质可能会在不同的水平上被S酰化，例如，我们最近的研究表明，许多信号蛋白的S-酰化化学计量低（~1％），而Caveolin-1几乎100％被S-酰化。诸如PEG开关和酰基PEG交换之类的技术能够确定S-酰化位点的化学计量，但它们是基于抗体的，仅允许分析单个蛋白质，研究者需要开发创新的方法来实现S酰化位点化学计量的蛋白质组规模分析。
4.3 单细胞S-酰基组学
S-酰化的蛋白质和复合物可能以不同的水平存在于不同的细胞状态和类型中，因此，最关键的是要了解单细胞分辨率下蛋白质S-酰化的动态变化。由于大多数S-酰化蛋白质的丰度低，当前的S-酰蛋白质组学分析需要微克至毫克的蛋白质裂解物。为了实现单细胞S-酰基蛋白质组学，研究者需要开发小型化和流线型的样品处理方法以最大程度减少样品损失，并且必须建立更灵敏的蛋白质组学方法以检测和定量少量S-酰基化的蛋白质或肽。
5.总结
在过去的14年里，S-酰基蛋白质组学取得了显著的进展， S-酰基蛋白质组的技术越来越成熟。S-酰基蛋白质组学领域已从定性S-酰基蛋白质组学转向功能性S-酰基蛋白质组学，这为S-酰基化在生理和疾病中的作用提供了新颖的见解。通过与新的PAT/APT探针和抑制剂结合，我们预计S-酰基蛋白质组学将在理解疾病机制、发现新的生物标志物和治疗靶点方面发挥越来越重要的作用；此外，我们期待创新的S-酰化蛋白质组学技术将被开发出来，以解决该领域的关键挑战，并彻底改变蛋白质S-酰化研究。