世界首例小鼠体内的标记治疗 - -体内金属催化反应治疗新一代癌症的战略-

世界首例小鼠体内的标记治疗 - -体内金属催化反应治疗新一代癌症的战略-

由理化学研究所(理研)开拓研究总部田中生物机能合成化学研究室的田中克典主任研究员(东京工业大学物质理工学院应用化学系教授、理研科技枢纽产连总部巴顿区域研究推进计划糖链目标研究小组副小组组长)、肯·沃德·沃恩研究员(该小组研究员)等国际共同研究小组， 通过在小鼠体内进行过渡金属催化[1]反应，对癌细胞选择性地共价键合(标记)抗癌活性分子，从而治疗成功。 本研究成果是在小鼠体内实现利用过渡金属催化反应控制药效的“生物体内合成化学治疗”的首次例子，有望作为癌症治疗的新战略应用。 如果能利用过渡金属催化反应，在癌细胞上选择性地激活惰性或弱活性的药物，将会减轻药物带来的副作用。 但是，由于难以向体内的癌细胞选择性地送入金属催化剂，而且在体内金属催化剂容易失活，所以迄今为止无法有效地治疗。 国际联合研究小组此次利用自行开发的“添加糖链的白蛋白蛋白质与金催化剂的复合体”，使抗癌活性物质选择性地与小鼠体内的癌细胞结合。 结果，药效被癌细胞选择性增强，不引起副作用，成功抑制了癌症转移的阻碍和癌细胞的增殖。 本研究刊登在科学杂志《科学高级》在线版( 4月23日:日本时间4月24日)上。

背景 在癌症药物开发中，不仅要表现出高抗癌活性，抑制副作用也很重要。 因此，将无活性或活性弱的药物在体内的癌细胞中选择性地活性化的“前药法[2]”作为有效的癌症治疗战略正在被广泛研究。 由于过渡金属催化剂能对各种反应基质发生各种各样的反应，因此作为体内的药剂活性化方法之一备受瞩目。 但是，很难向体内的癌细胞选择性地输送过渡金属催化剂，而且过渡金属催化剂会与谷胱甘肽[3]等各种生物分子配位，失去催化活性。 因此，到目前为止，还不能通过体内的过渡金属催化剂有效地进行癌症治疗。 此前，国际联合研究小组发现，通过疏水性配体[4]向血清白蛋白蛋白质的疏水性口袋中导入过渡金属催化剂，过渡金属催化剂在生物体内环境中得以稳定化，并能有效进行反应(注1 )。 进而，通过在白蛋白表面的氨基中导入多个天冬氨酸结合型糖蛋白糖链( N-型糖链)，发现白蛋白通过“糖链模式识别”的效果，选择性地转移到体内特定的内脏器官和癌症，注2-3 )。 根据这些发现，通过向附加糖链并具有组织导向的白蛋白导入过渡金属催化剂，使“糖链加成白蛋白金属催化复合体”转移到体内期望的内脏器官，成功发生了当地期望的金属催化反应，注4 )。 因此，这次通过对小鼠体内的癌症选择性地进行过渡金属催化反应，以无副作用的癌症治疗为目标。

图1在小鼠体内特定部位起作用的人工金属酶

通过将过渡金属催化剂放入血清白蛋白的疏水性袋中，金属催化剂在体内也能稳定化。 另外，通过在白蛋白表面导入N-型糖链，可以将金属催化剂运送到体内的特定部位，在其体内的当地发生金属催化反应。

注1 ) 2019年7月2日新闻发布会“催化“现场合成”治疗癌症” 注2 ) 2018年7月4日新闻发布会“以糖链的模式识别癌症” 注3 ) 2020年10月21日新闻发布会“有序地将糖链的不均匀性高次化以发现癌症” 注4 ) 2017年2月15日新闻发布会“利用目标内脏器官实现金属催化反应

研究方法和成果 国际联合研究小组通过过渡金属催化反应，尝试了将抗癌活性物质共价键合(标记)在体内的癌细胞表面进行治疗(图2 )。 通过带有α( 2，3 )唾液酸的糖链加成白蛋白金催化复合体，选择性地将金催化转移(靶向)到体内的Hela细胞(宫颈癌细胞)。 然后，注射抗癌活性物质与炔丙基酯结合的物质，通过金催化剂的酰胺化反应，使抗癌活性物质与癌细胞表面蛋白质的氨基结合。 像这样，选择性地向癌症标记抗癌活性物质的结果，我认为不影响周边的正常组织，只在癌症中发挥抗癌活性。

图2体内标记治疗概要首先，用带有α( 2，3 )唾液酸的糖链附加白蛋白的“糖链模式识别”瞄准Hela癌细胞(①)。 接着，对于细胞表面蛋白质的氨基，通过金催化剂的炔丙基酯的酰胺化反应标记抗癌活性分子(②)。 结果，癌症选择性地表现出抗癌活性物质的药效，无副作用地阻碍癌症的转移和增殖(③)。

首先，调查了体内标记治疗能否抑制癌症的转移(图3A )。 此时，作为标记癌细胞的抗癌活性物质，使用了与细胞粘附相关的膜蛋白整合素的抑制分子环状RGDyK肽。 也就是说，向小鼠腹腔内注射荧光酶荧光素酶标记的Hela细胞，制作了转移癌模型。 从这个时候开始癌症的转移慢慢进行。 注射Hela细胞15分钟后，依次向腹腔内注射糖链加成白蛋白金催化复合体和带有炔丙基酯的环状RGDyK肽，进行体内标记。 结果，癌细胞的转移得到了抑制，小鼠的存活率显着提高(图3B-D )。 在只注射了作为对照的环状RGDyK肽的组中，完全不能抑制癌症转移。 认为这是因为环状RGDyK肽分散在小鼠腹腔内，减弱了癌细胞表面对整合素的效果。 也就是说，在体内标记治疗中，糖链附加白蛋白金催化复合体选择性地识别小鼠腹腔内漂浮的癌细胞，将环状RGDyK肽标记在该癌细胞表面的氨基上。 于是，癌细胞表面的环状RGDyK肽的浓度显着上升，会与整合素发生强烈的相互作用。 结果被认为有效地阻碍了癌细胞的粘附，防止了癌症的转移。

图3体内标记法抑制癌症转移

( a )体内标记法抑制癌症转移的机制:在体内靶向癌症(①)后，通过金催化反应标记环状RGDyK肽(②)。 环状RGDyK肽在癌细胞表面与参与细胞粘附的整合素强烈相互作用，结果阻碍了癌细胞的细胞粘附，即转移(③)。 ( b )通过荧光素酶发光成像的癌转移可视化。 颜色越强表示越容易发生转移。 可以看出，在条件4的情况下，癌症的转移得到了最大抑制。 ( c )发光成像的定量数据。 ( d )小鼠的生存曲线。 并且，调查了针对腹腔内生长的癌症，标记更强的抗癌活性物质金霉素[5]能否抑制癌症的增殖(图4A )。 和前面的方法一样，向小鼠腹腔内注射Hela细胞后，经过一周时间腹腔内生了癌。 针对该癌胚模型，向腹腔内依次注射了糖链加成白蛋白金催化复合体、以及带有炔丙基酯的强力霉素。 结果表明，癌细胞的增殖得到了明显抑制，小鼠的存活率也有所提高(图4B-D )。 通过金催化反应，癌细胞表面蛋白质中带有炔丙基酯的强力霉素发生标记。 之后，通过内毒素(细胞内迁移)进入细胞内，通过细胞内酶切断连接蛋白质和强力霉素的结合部分，抗癌活性主体的强力霉素在癌细胞内释放，消除癌细胞，获得了治疗效果。

( a )体内标记法抑制癌症转移的机制:在体内靶向癌症(①)后，通过金催化反应标记环状RGDyK肽(②)。 环状RGDyK肽在癌细胞表面与参与细胞粘附的整合素强烈相互作用，结果阻碍了癌细胞的细胞粘附，即转移(③)。 ( b )通过荧光素酶发光成像的癌转移可视化。 颜色越强表示越容易发生转移。 可以看出，在条件4的情况下，癌症的转移得到了最大抑制。 ( c )发光成像的定量数据。 ( d )小鼠的生存曲线。 并且，调查了针对腹腔内生长的癌症，标记更强的抗癌活性物质金霉素[5]能否抑制癌症的增殖(图4A )。 和前面的方法一样，向小鼠腹腔内注射Hela细胞后，经过一周时间腹腔内生了癌。 针对该癌胚模型，向腹腔内依次注射了糖链加成白蛋白金催化复合体、以及带有炔丙基酯的强力霉素。 结果表明，癌细胞的增殖得到了明显抑制，小鼠的存活率也有所提高(图4B-D )。 通过金催化反应，癌细胞表面蛋白质中带有炔丙基酯的强力霉素发生标记。 之后，通过内毒素(细胞内迁移)进入细胞内，通过细胞内酶切断连接蛋白质和强力霉素的结合部分，抗癌活性主体的强力霉素在癌细胞内释放，消除癌细胞，获得了治疗效果。

(图4体内标记法抑制癌症增殖

( a )体内标记法抑制癌症增殖的机制:①靶向癌症后，②标记强力霉素衍生物。 ③被表面蛋白质标记的强力霉素被内吞(细胞内迁移)，在细胞内受到组织蛋白酶b (酶)的切断，活性主体强力霉素被释放。 结果，癌细胞被导向细胞凋亡。 ( b )通过发光成像实现癌症增殖的可视化。 可以看出，在条件4的情况下，癌症的增殖得到了最大抑制。 ( c )癌症增殖的比例。 ( d )小鼠的生存曲线。

补充说明 1 .过渡金属催化剂 一种催化剂，由属于周期表第3族至第11族的过渡金属元素构成。 由于这些元素对特定的官能团显示出很强的亲和性，所以已知会催化各种各样的有机化学反应。 2 .专业拖动法 药物制剂是以药物靶部位的生物体内反应为诱因，设计成具有药效的化合物的药物。 通过使用药物前体的方法，可以期待药物的组织选择性的提高带来的副作用的减轻、吸收性的提高、代谢稳定性的提高。 3 .谷胱甘肽 是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽，以高浓度存在于细胞内。 通过与活性氧种类和生物分子发生反应来保护细胞等，在维持生命中起着重要的作用。 一般来说，半胱氨酸的硫醇基使过渡金属催化剂失活。 4 .配体 是指通过与特定的生物分子结合而发挥生理作用的物质。 一般多指与受体结合的分泌因子(激素和生长因子等)。 5 .强力霉素 是四环素类的抗癌活性物质之一，通过进入癌细胞的DNA碱基对之间，阻碍DNA和RNA的生物合成，表现出抗癌活性。

国际联合研究小组 物理化学研究所 开拓研究总部田中生物功能合成化学研究室 主任研究员田中克典 (东京工业大学物质理工学院应用化学系教授、理研科技枢纽产联总部巴顿区研究推进项目糖链瞄准研究小组副小组组长) 研究员肯沃德·沃恩( Kenward Vong ) (理研科技枢纽产连总部巴顿区研究推进计划糖链目标研究小组研究员) 技术人员ⅱ浦野清香 特别研究员伊戈尔·纳西布林( Igor Nasibullin ) 研究生研究协会(研究当时)坪仓一辉 生命机能科学研究中心 生物功能动态成像研究小组 田原强研究员 生物功能评价研究小组 小组组长(研究当时)尾上浩隆(奥野浩隆) 健康病态科学研究小组 队长渡边恭良(渡边安祥) 喀山大学生物机能化学研究室(理研-喀山联合研究室) 副教授阿尔米拉·库尔班加列娃( Almira Kurbangalieva ) 早稻田大学研究生院理工学术院 中尾洋一教授 研究支援 本研究是在日本医疗研究开发机构( AMED )尖端生物制药等基础技术开发事业“基于糖链附加人工金属酶的生物体内合成化学治疗(研究代表者:田中克典)”的支援下进行的。 原论文信息

国际联合研究小组 物理化学研究所 开拓研究总部田中生物功能合成化学研究室 主任研究员田中克典 (东京工业大学物质理工学院应用化学系教授、理研科技枢纽产联总部巴顿区研究推进项目糖链瞄准研究小组副小组组长) 研究员肯沃德·沃恩( Kenward Vong ) (理研科技枢纽产连总部巴顿区研究推进计划糖链目标研究小组研究员) 技术人员ⅱ浦野清香 特别研究员伊戈尔·纳西布林( Igor Nasibullin ) 研究生研究协会(研究当时)坪仓一辉 生命机能科学研究中心 生物功能动态成像研究小组 田原强研究员 生物功能评价研究小组 小组组长(研究当时)尾上浩隆(奥野浩隆) 健康病态科学研究小组 队长渡边恭良(渡边安祥) 喀山大学生物机能化学研究室(理研-喀山联合研究室) 副教授阿尔米拉·库尔班加列娃( Almira Kurbangalieva ) 早稻田大学研究生院理工学术院 中尾洋一教授 研究支援 本研究是在日本医疗研究开发机构( AMED )尖端生物制药等基础技术开发事业“基于糖链附加人工金属酶的生物体内合成化学治疗(研究代表者:田中克典)”的支援下进行的。 原论文信息

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Kenward Vong, Tsuyoshi Tahara, Sayaka Urano, Igor Nasibullin, Kazuki Tsubokura, Yoichi Nakao, Almira Kurbangalieva, Hirotaka Onoe, Yasuyoshi Watanabe, and Katsunori Tanaka, "Disrupting tumor onset and growth via selective cell tagging (SeCT) therapy", Science Advances, 10.1126/sciadv.abg4038

发表者 物理化学研究所 开拓研究总部田中生物功能合成化学研究室 主任研究员田中克典 (东京工业大学物质理工学院应用化学系教授、理研科技枢纽产联总部巴顿区研究推进项目糖链瞄准研究小组副小组组长) 研究员肯沃德·沃恩( Kenward Vong ) (理研科技枢纽产连总部巴顿区研究推进计划糖链目标研究小组研究员)

田中克典主任研究员(左)、肯沃德·沃恩研究员( 2019年拍摄)

( a )体内标记法抑制癌症转移的机制:在体内靶向癌症(①)后，通过金催化反应标记环状RGDyK肽(②)。 环状RGDyK肽在癌细胞表面与参与细胞粘附的整合素强烈相互作用，结果阻碍了癌细胞的细胞粘附，即转移(③)。 ( b )通过荧光素酶发光成像的癌转移可视化。 颜色越强表示越容易发生转移。 可以看出，在条件4的情况下，癌症的转移得到了最大抑制。 ( c )发光成像的定量数据。 ( d )小鼠的生存曲线。 并且，调查了针对腹腔内生长的癌症，标记更强的抗癌活性物质金霉素[5]能否抑制癌症的增殖(图4A )。 和前面的方法一样，向小鼠腹腔内注射Hela细胞后，经过一周时间腹腔内生了癌。 针对该癌胚模型，向腹腔内依次注射了糖链加成白蛋白金催化复合体、以及带有炔丙基酯的强力霉素。 结果表明，癌细胞的增殖得到了明显抑制，小鼠的存活率也有所提高(图4B-D )。 通过金催化反应，癌细胞表面蛋白质中带有炔丙基酯的强力霉素发生标记。 之后，通过内毒素(细胞内迁移)进入细胞内，通过细胞内酶切断连接蛋白质和强力霉素的结合部分，抗癌活性主体的强力霉素在癌细胞内释放，消除癌细胞，获得了治疗效果。

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