21091 双特异性抗体工艺开发：球形和孔状双特异性抗体的组装和纯化
核心内容：该研究开发了一种高效的组装和纯化球形孔状双轻链双特异性抗体的方法。该实验中将两种针对不同抗原的特异性半抗体分别在大肠杆菌细胞中表达，并使用独立的Protein A亲和层析捕获。在组装时，CH3结构域上的球形和空穴突变促进了异源二聚体的形成。铰链区的二硫化物被还原剂还原再被空气氧化，在两个互补的半抗体之间形成二硫键。而未发生反应的半抗体、非共价连接的同源二聚体、共价连接的同源二聚体和非共价连接的异源二聚体，也就是与目标产品密切相关的杂质，很难通过标准方法去除。研究人员通过对半抗体的分子特性进行表征和高通量筛选预测了柱层析的性能，从而得以快速开发下游纯化步骤，去除和目标产品相关或和工艺过程相关的杂质。
1. 实验材料与方法（层析相关）
1.1 层析柱尺寸：0.66 cm直径，20 cm柱高
1.2 亲和层析：流速40CV/h；EQ 25mM Tris，25 mM NaCl，pH 7.7；载量14 g/L Resin；再生100 mM acetic acid，pH 2.9。
1.3 组装：使用1M L-精氨酸将两个半抗体Protein A Pool 的pH调整到8.0，各自在35℃孵育3 h后混合，立即加入还原型谷胱甘肽（GSH），GSH和BsAb摩尔比200：1，35℃孵育6 h后冷却至室温并调节到下一步层析上样条件。
2. 实验结果
基于疏水性的差异，通过反相高效液相色谱可以区分半抗体、共价连接的同源二聚体和共价连接的双特异性异源二聚体（图一），并测定球形孔状BsAb组装反应的时间（图二）。
值得注意的是，在装配反应的放大过程中，需要考虑到对溶液中溶解氧的控制，这些溶解氧可能会在装配过程中耗尽。这一过程中对空气覆盖层压力、温度和混合的监控决定了工艺的稳健程度。
通过对离子交换、混合模式和疏水作用层析树脂的高通量筛选，比较半抗体与全长双特异性抗体的分配系数（Kp），可以快速预测分离这些产品相关杂质的色谱条件（图三，图五和图七）。差分log(Kp)图（dlog(Kp)）是通过绘制半特异性抗体的log(Kp)图和双特异性抗体的log(Kp)图之间的差来生成的，用以说明最有效的分离条件（图四和图六）。dlog(Kp)绝对值≧ 0.4说明该条件下可以发生有效的区分。具有低组装双特异性抗体log(Kp)（≦0.5）和高dlog(Kp)绝对值的条件可以产生高收率和有效的对半抗体的区分。即半抗体的结合强度比双特异性抗体低，可以在淋洗过程中去除。
log(Kp)图显示，半抗体在离子交换层析树脂上的结合比组装的双特异性抗体更紧密。预计在盐梯度下会在双特异抗体之后洗脱。pH梯度或许可以使混合模式层析树脂有效地从弱结合的半抗体中分离双特异性抗体。而双特异性抗体在所有测试条件下都和HIC填料结合紧密。基于高通量筛选结果，在制备级离子交换层析柱上对双特异性抗体组装池进行盐梯度洗脱，将双特异性抗体从半抗体和抗体片段中分离出来（图八）。离子交换池在制备规模的混合模式层析柱上进一步处理。通过离子交换和混合模式层析， SEC检测结果表明可以从组装池中去除HMWS和半抗体（图九）。然而，SEC无法区分共价连接的和非共价连接的双特异的异源二聚体和同源二聚体，因为它们大小都在150 kDa。但是通过反相高效液相色谱分析结果显示，大部分抗体都组装成共价连接的双特异性抗体，然后通过离子交换和混合模式层析去除了未反应的半抗体和同源二聚体（图十）。
整个下游纯化过程的除杂率见表一。各层析步骤的顺序满足最大限度地提高收率和纯度，同时尽量减少pH调节和稀释过程。浓缩和制剂则采用典型的超滤/透滤(UFDF)方法。
3.结论
本文建立了一种简化的纯化球形孔状双特异性抗体的方法。具有球形和孔状结构半抗体的构建使双轻链BsAb的高效组装成为可能。高通量筛选方法允许快速开发柱层析条件，以去除和产品相关的杂质。SEC和反相高效液相色谱分析表明，下游离子交换层析过程清除了大多数与产品相关的杂质。又通过混合层析步骤实现了进一步纯化。产品质量可用于临床生产。该纯化方法显著提高了双轻链双特异性抗体纯化工艺的收率和质量，并且在现有的设备条件下是可行的。该开发方法可作为快速开发球形孔状双特异性抗体纯化工艺的标准方法。只需要对单克隆IgG抗体的结构进行细微的调整，即可大规模高效地纯化双轻链双特异性抗体。