科研 | 中科院储成才 & 白洋等：NRT1.1B通过调控水稻根系微生物组参与氮利用（IF：35.724）
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在土壤中，植物的根系除了固着植物并作为吸收水分和营养的器官外，还是微生物栖息和繁衍的场所。许多微生物参与土壤养分的转化，包括植物生长必须的氮、磷元素循环。根系微生物的决定因素，主要包括根不同区域、土壤类型、地理位置、营养状态、发育阶段和宿主基因型。然而在植物群体水平遗传因素对根系微生物组的影响尚未清楚。水稻是世界范围内种植最广泛的主食，籼稻和粳稻是被大家广为熟知的两个栽培水稻亚种。籼稻比粳稻有更高的氮利用效率。本研究中作者使用68个籼稻和27个粳稻品系为研究材料，发现在田间籼粳稻招募不同的根系微生物组。籼稻比粳稻有更高的微生物多样性，其中包括更多氮代谢相关的属，并且证实水稻的氮转运和受体NRT1.1B基因与大部分籼稻富集菌有关。宏基因组测序显示，在nrt1.1b突变体的根系微生物组中，氨化过程较少。研究者从籼稻和粳稻的根系分离出1,079株细菌纯培养，设计人工重组群落，验证了籼稻富集菌比粳稻富集菌具有明显的生长促进作用。该研究发现了植物基因型和根系微生物之间的关系，将为改善作物氮利用的育种策略提供有用信息。
论文ID
原名：NRT1.1Bis associated with root microbiota composition and nitrogen use in field-grown rice
译名：NRT1.1B与田间条件下水稻根系微生物组成及氮利用有关
期刊：Nature Biotechnology
IF：35.724
发表时间：2019年4月
通信作者：储成才& 白洋
通信作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所
实验设计
本文挑选了来自44个国家的68个籼稻和27个粳稻品系，种子脱壳后进行表面消毒，然后在MS琼脂培养基上发芽，种子萌发15天后，转移到海南陵水（北纬18.512°，东经110.044°）两个常年种植水稻的地块，各品系随机排布种植。在相同氮施用量下，移栽8周后采集水稻根样品，设置三个生物学重复，摇动根部以除去松散粘附的土壤，然后洗涤直到没有可见的土壤颗粒残留，将距地面10 cm长的根切成2 mm的小段，并放入2 ml离心管中，共收集563份水稻根系样本，并且也采集了12个未种植的土壤样本。同时也采集了NRT1.1B基因的野生型和突变型等的水稻根系样本。对根系和土壤样本进行DNA提取后，利用16S rRNA扩增子测序对V5-V7高变区进行高通量测序，利用QIIME、USEARCH等软件结合自己编写的脚本进行生物信息学分析，解析微生物群落结构，用FAPROTAX对原核类群进行功能注释。用机器学习中的随机森林模型，建立了区分籼粳稻微生物群落的结构模型，并且进行了测试，证实了模型的准确性。除此之外，对野生型和突变型NRT1.1B 水稻根系微生物进行了宏基因组测序和KEGG功能注释分析，对从根部获得的细菌进行了分离培养和测序鉴定，建立了首个水稻根系细菌资源库，并且设计人工重组群落。
实验内容
1 籼稻和粳稻的根系微生物组不同
为了探索栽培稻根系微生物组的变异，我们在海南省陵水农场的两块地种植68个籼稻和27个粳稻品种（附表1. 两块地的土壤属性和耕作历史）。这些品种来源于44个不同国家地区（图1a；附表2）。稀释曲线分析显示，我们的群体捕获了每个水稻亚种的大部分根系微生物群种类（附图1）。为避免来源于种子的微生物引起污染，我们首先对种子灭菌，然后在MS培养基上生长15天，再移植于田间，各品种随机排布种植（图1b）。这两块地在过去10年一直种植水稻，在2014-2016年存在明显不同的耕作方式(附表1；方法)，这样的设计有利于我们研究田间不同种植方式下水稻根系微生物组的稳定性。在水稻转移至土壤中8周后取样，根系微生物相对稳定。对于每个品系，我们从三个独立的植株获取三个样本(图1b)。我们在每块地收集12个末种植的土壤样本。采用PCR扩增细菌16S rDNA的V5-V7区(引物799F和1193R)并进行Illumina测序。我们从563个样本中共获得了19,976,393条高质量的序列（平均：35,482条；范围: 5,386–125,709条）。我们用USEARCH分析高质量的序列，移除嵌合体和细胞器序列，产生5,141个OTUs(平均每个样本1,455个OTUs；附表3)。
我们发现根系微生物的组成在水稻亚种中存在差异。基于Bray-Curtis距离PCoA显示，地块I中籼稻和粳稻的根系微生物组形成两个不同的簇，沿第一主轴分离（图1c；附图2），表明水稻亚种分化是微生物组变异的最主要影响因素。正如预期的那样，由于土壤差异，地块II中的根系微生物组与田地I中的根系微生物组不同（附图3；附表1），但籼稻和粳稻品种之间在两块地显著分开是一致的（图1d；附图2和3）。α多样性分析揭示了籼稻和粳稻品种之间的显著差异（图1e；附图4）。籼稻的根系微生物群在两块地均具有比粳稻更高的多样性（图1e），表明籼稻的根系比粳稻招募了更多种类的微生物。籼稻和粳稻根系微生物组的差异是显著的，并且在门的水平上是可检测的（图1f）。在两块地中，与粳稻相比，籼稻中的δ-变形菌纲、放线菌门、产酸菌门、拟杆菌门、螺旋菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门和疣微菌门的相对丰度较高，而粳稻中α-变形杆菌纲的相对丰度较高（Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05，附表4）。这些数据表明，根系微生物组在这些水稻亚种中具有可重复性。
图1 水稻籼稻和粳稻的根系微生物组
2 根系微生物组作为区分籼、粳稻的生物标记
接下来，我们分析了根系微生物组成员是否可以与其他性状一样，如谷粒形状、叶色和基因组特征用作生物标记来区分籼稻和粳稻。我们基于地块II的根系微生物组数据，采用机器学习的随机森林方法，在门、纲、目、科、属和OTUs层面分别建立预测模型，其中在科水平判别的准确率高达83.7%(附表5)。我们进行了10X交叉验证，重复5次，以评估生物标记的重要性。当交叉验证错误率在18个特征时，交叉验证误差曲线稳定。因此，我们将这18个科作为生物标记（图2a）。其中，15个科在籼稻的相对丰度高于粳稻，3个科在粳稻中表现出较高的相对丰度（FDR校正P <0.05，Wilcoxon秩和检验；图2b）。籼稻富集的特征更多与籼稻拥有更高的微生物多样性结果一致。
我们的模型准确预测了测试区域中的籼稻和粳稻品种。该模型显示，将地块I的样品作为测试集，应用随机森林模型预测准确率为86%，其中籼稻预测准确率为94.5%，粳稻的准确率为77.5%（图2c；附表5）。该模型还成功分类了IR24（籼稻）和ZH11（粳稻），它们未包括在海南种植的品种中，并且在北京的两个农场种植，距陵水农场2,482公里（图2d：附表5）。由于根系微生受地理位置的显著影响，而我们的模型适合于过去两年的六块地，以后用来自更多地点、更多品种的数据可能进一步改善模型的准确率。这些结果表明，根系微生物可以作为区分籼稻和粳稻的生物标记。
图2 随机森林模型准确预测籼稻和粳稻亚种的细菌分类群
3 根系微生物和氮利用效率
接下来，我们检测了OTU水平的籼稻和粳稻亚种根系微生物群的差异。首先，我们根据曼哈顿图查看OTUs在分类学上的分布（图3a，b；附表6）。在这两块地中，籼稻富集的OTUs分布于多个门，包括δ-变形菌纲、放线菌门、产酸菌门、拟杆菌门、螺旋菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门和疣微菌门（FDR校正P <0.05，Wilcoxon秩和检验；图3a，b；附表6）。而粳稻富集的OTUs主要属于变形菌门、拟杆菌门、和厚壁菌门（FDR校正P <0.05，Wilcoxon秩和检验；图3a，b；附表6）。其次，我们在两个区域中检测到富含籼稻的OTU或富含粳稻的OTU的显著重叠（图3c,d）。在两个地块中籼稻富集了141个OTU（在地块I中为57.8％；在地块II中为95.9％），与土壤相比，其中51个OTU占富含籼稻的OTU累积丰度的76.4％（图3c；附图5和附表6）；16个OTU（地块I 47％，地块II为76.2％）在粳稻中富集，14个OUT在粳稻中富集，占粳稻富集菌丰度的99%（图3d；附图5和附表6）。籼粳稻间大多数相对丰度差异的OTUs在两个测试地点保持一致。
我们发现许多籼稻富集OTUs具有与氮循环相关的功能。我们使用FAPROTAX（一个基于当前培养菌株的文献将微生物群落特征转换为推定的功能特征的数据库）对两个地块中共有的籼粳稻富集OTU的功能进行了注释，这些特定的OTU与37个通路有关（附图6）。值得注意的是，大多数籼稻富集的OTU（25.5％，141个OTU中的36个）与氮循环有关，特别是硝酸盐氨化，硝酸盐反硝化，硝酸盐还原，硝化和亚硝酸盐氨化通路中显著富集(置换检验P = 0.025，图3e,g；附表7)，反映了水稻在淹水土壤中使用的氮形态的复杂性。富含籼稻的氮相关OTU的累积丰度（36个OTU，11.7％）优于粳稻富集的那些（5个OTU，3.4％；附表7）。此外，在OTUs累计丰度角度，籼稻富集的35个氮相关菌丰度为11.7%，高于粳稻c富集的5个氮相关OTUs丰度3.4%。此外，在两块地中表现为籼稻富集的9个最高丰度的功能中，6个与氮循环相关，丰度占籼稻富集功能的53.3%(图3i,j；附表7)，表明氮转化在籼稻根系环境中比粳稻活跃，这与先前报道的籼稻品种中的NUE较高一致。值得注意的是，与苗期植物相比，田间水稻生长后期的氮循环相关OTU的相对丰度增加（图3f,h和附表7），表明水稻可能积极协调环境微生物群落调节土壤养分，以实现最佳植物生长。
图3 籼稻和粳根系微生物组物种分类和功能特征的差异
4 NRT1.1B和根系微生物组差异
NRT1.1B作为氮转运蛋白和受体起作用，据报道它可以促进籼稻和粳稻的NUE差异（Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies，doi:10.1038/ng.3337）。我们假设籼稻和粳稻根系微生物群的差异受NRT1.1B的调控。我们发现NRT1.1B自然变异的单核苷酸多态性与籼粳稻根系微生物组氮代谢功能相关(地块I中P = 2.2×10–16；地块II中P = 1.8×10–12, 双尾t-test, 图4a；附图7)，表明NRT1.1B可能参与水稻根系微生物组的建立。
为了研究NRT1.1B在水稻根系微生物组的募集作用，我们进行了16S rRNA扩增子测序，以分析在北京昌平农场种植的野生型ZH11和nrt1.1b缺失突变体的根系微生物。我们发现籼稻富集OTUs的丰度相关。基于Bray-Curtis距离的PCoA显示nrt1.1b突变体与野生在第1/2主轴分开，表明NRT1.1B在水稻根系微生物组形成中起重要作用(图4b；附图8)。在全因子重复中获得了类似的结果（附图8）。值得注意的是，在陵水农场的上述两个地块中，nrt1.1b突变体中下调的OTU与籼稻中富集的OTUs显著重叠（图4c,e；附图8,9；附表8）。例如，在nrt1.1b突变体中下调的67.6％（176个中的119个）OTU在至少一个地块中与籼稻富集的OTU重叠，并且在两个地块中49.6％（141个中的70个）籼稻富集的OTU是nrt1.1b突变体下调，这部分占籼稻富集OTU总丰度的86.5%(附表8)。参与氮循环的许多细菌，包括在籼稻中相对丰度最高的厌氧粘细菌，在nrt1.1b突变体中丰度下降(图4c,e；附表8)，表明NRT1.1B有助于水稻根系微生物组大部分籼稻富集的细菌的招募。
我们还发现在昌平农场，亲本日本晴NRT1.1Bjaponica的根系微生物群与近等基因系日本晴NRT1.1Bindica之间存在可测量的差异（图4b；附图8）。具体而言，NRT1.1Bindica富集的七个OTU中有六个与两块地中籼稻富集的OTU一致(图4d，f；附图8和9；附表8)。这6个OTUs占籼稻富集OTU总丰度的29%(附表8)。这些结果进一步证明NRT1.1B与水稻根系微生物组的建立有关，并有助于籼稻和粳稻亚种间根系微生物组的分化。
为进一步探讨NRT1.1B在根系微生物组建立中的作用，我们对nrt1.1b和野生型ZH11根系微生物组进行了宏基因组测序。在除去来源植物的序列后，我们每个样品获得平均30.8 Gb的微生物序列（原始数据保存在BIG数据中心的基因组序列档案中，编号为CRA001362）。我们使用从头组装的策略来预测基因并通过KEGG对它们进行注释。对其中基因与氮循环通路相关的条目进行筛选和分析，与之前功能预测的结果一致，即在野生型中花11和nrt1.1b缺失突变体的根系微生物中几个氮循环相关的基因表现出相对丰度的差异(附表9)。氨化过程中三个关键基因（NapA，NapB和NirD）的相对丰度在nrt1.1b的根系微生物组中比野生型减少2.8-5.9倍，而氮循环中其他基因的丰度没有显著差异（图4g；附表9）。NapA和NapB编码硝酸还原酶，负责将硝酸盐还原成亚硝酸盐；NirD参与亚硝酸盐转化为铵。这些数据表明，NRT1.1B与氨化过程中含有关键基因的根系细菌的相对丰度有关：这些根系微生物可能在根系环境催化反应合成氨。
图4 NRT1.1B有助于籼稻和粳稻根系微生物组的差异
5 培养水稻根系微生物组
为了研究籼稻或粳稻根系微生物特异富集OTU的功能，我们建立了在昌平农场种植的水稻品种IR24和日本晴的根系微生物组的分类学多样性细菌培养物资源库。为了最大化分离IR24和日本晴根系募集的细菌的可能性，每个品种都种植在两个不同的地点。采用梯度稀释的方法在96孔细胞培养板中对细菌进行分离培养。基于454焦磷酸测序的鉴定方案，我们建立了两步标签靶向V5-V7区16S rRNA结合Illumina高通量测序鉴定物种分类的方法（附图10）。与454焦磷酸测序方案（附图11）中将一板中有标签的孔中PCR产物混合的方法相比，我们的方法对每个孔单独培养的细菌进行鉴定，可有效的避免不同板、孔间的嵌合体形成（附图10）。同时，部分根用于培养非依赖性16S rRNA基因分析，以在我们的培养物资源库中交叉引用OTU定义的分类群与培养的菌落形成单位（CFU）。
总共从土壤中生长的IR24和日本晴的混合根样品中回收了13,512个CFU（附表10）。在去除低质量序列后，我们使用UNOISE算法去除嵌合体和低丰度序列（n<8）。这13,512个CFU包含1,041条非冗余细菌16S rRNA基因序列，占籼稻自然样本16S鉴定种类的68.8%，和粳稻的71.7%（至少一个样本中相对丰度> 0.1％；图5a，b和附表10）。我们鉴定根系来源的CFU包括了常见的四大菌门和27个科与水稻根系相关。因此，与水稻相关且可重复的大多数细菌类群具有可培养的成员。
我们从这13,512个CFU中选择了具有代表性的细菌核心菌株，并进行纯化和Sanger测序16S rRNA的连续步骤验证了它们。为了增加我们的培养物资源库的种内遗传多样性，对16S序列相同但来源不同的菌株进行保留，其代表独立的宿主起源事件（图5c）。总之，我们获得了包含22个细菌目的1,079个根系起源的隔离群（图5c和附表11），这将使未来能够研究水稻根系相关细菌群落的功能。
图5 水稻根系微生物的分离培养和鉴定
6 合成群落改进水稻氮吸收
为了探究籼稻和粳稻富集细菌的氮相关功能，我们使用了基于粘土的合成群落系统，其中不同的氮源，如硝酸盐，铵和可溶性有机氮（附表12），可以精确控制。我们在早期的对比实验中设计的SynCom分别包括籼、粳稻富集且与NRT1.1B相关的OTUs。我们选择了16种籼稻富集和3种粳稻富集的OTU。在SynCom实验中选择培养的细菌与OTUs至少相似度大于97%的细菌种类用于实验。在硝酸盐或铵充足的条件下，籼稻和粳稻富集的SynCom主要抑制IR24的生长，这可能是因为SynComs中的细菌与水稻竞争无机氮（附图12，13；附表13）。值得注意的是，我们发现当有机氮是唯一的氮源时，SynCom显著促进了IR24的生长（图6；附表13）。与包括16个籼稻富集SynCom共培养14天后，IR24植株的根长得更长，地上部分更大，而粳稻富集的3个SynCom也促进了根和芽的生长，但与籼稻富集的SynCom相比，其程度较小（图6；附表13）。土壤富集的细菌和热灭活的16种籼稻富集的细菌和3种粳稻富集的细菌未显示出生长促进作用（图6；附表13）。这些初步数据表明，籼稻富集的有机氮相关功能可能有助于提高籼稻的氮利用效率。
图6 与粳稻富集的SynCom相比，籼稻富集的SynCom在有机氮供应下促进水稻生长的能力更强
讨 论
在长期的水稻种植历史中，亚洲出现了两种主要的栽培稻，即籼稻和粳稻，具有不同的基因型和表型。在这里，我们研究了在田间条件下生长的籼稻和粳稻多个代表性品系的根系微生物组的差异，显示籼稻和粳稻招募不同的根系微生物组（图1）。我们发现特异性生物标志物分类群可以用于区分籼稻和粳稻亚种（图2）。此外，我们报道NRT1.1B与根系微生物群中亚种特异性分类群的富集相关（图4），表明宿主基因型在固定环境条件下对根系微生物组的建立具有相当大的影响。由于NRT1.1B的自然变异解释了籼稻和粳稻根系微生物组中29.0％的差异丰度，因此鉴定水稻根系微生物组变异中涉及的其他关键基因和途径将是非常重要的。
宿主植物和根系微生物组之间的协调对于自然环境中的植物生长至关重要。我们发现籼稻品种的根系招募了较高比例的氮循环相关细菌（图3），表明氮素转化过程在籼稻根系环境中可能比粳稻更有效，这很好的解析了之前籼稻更高氮利用效率的现象。基于培养的细菌（图5）和使用人工重组群体技术，我们发现在附有机氮源时籼稻富集菌对水稻生长促进更加明显（图6）。我们猜测SynCom将有机氮转化为硝酸盐和铵，从而可以被水稻根系有效吸收。进一步研究各种SynComs可能有助于鉴定籼、粳稻特异富集细菌的功能。
有趣的是，水稻亚种根系微生物组的建立和差异与氮转运和受体基因NRT1.1B有关。因此，水稻根可能利用负责硝酸盐吸收的转运蛋白监测土壤中硝酸盐浓度的变化，进而可能诱导硝酸盐相关基因或根代谢物的表达，这可能影响根系微生物群的募集。利用拟南芥中NRT1.1B（chl1-9）特异性突变进行的进一步研究将有助于剖析硝酸盐转运和NRT1.1B在根系微生物组建立的过程。我们的数据表明，水稻植物协调根系微生物组获取来自土壤环境的氮来优化农业条件下的生长。根系微生物组、土壤氮循环、基因调控和宿主植物性状之间的关系可以为调节根系微生物组的技术铺平道路，从而提高作物生产力和可持续性。
评 论
本文主要通过16S rRNA测序和宏基因组测序，研究了田间环境下68种籼稻和27种粳稻的根系微生物群落结构，他们发现籼稻和粳稻形成了截然不同的根系微生物组，籼稻根系特异富集的微生物类群分布在δ-变形菌纲、放线菌门、酸酐菌门和拟杆菌门等，而粳稻根系富集的微生物主要集中在α-变形菌纲，根系微生物组分可以作为区分籼粳稻的生物标志。籼稻根系富集比粳稻更多与氮循环相关的微生物种类，具有更加活跃的氮转化环境，这很好的解析了之前籼稻比粳稻有着更高氮利用效率的现象。水稻通过NRT1.1B基因调控根系具有氮转化能力的微生物，改变根系微环境，影响籼梗稻田间氮利用效率。本文鉴定粳稻和籼稻特异富集的微生物，通过高通量微生物分离培养，获得了水稻根系70%的细菌种类，建立了首个系统性水稻根系细菌资源库。该研究结果为解析微生物群落调控植物氮营养，特别是籼稻与粳稻氮利用效率的分子机制提供了重要线索。
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