DNA甲基化测序方法介绍
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DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。
DNA 甲基化及CpG岛
DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体。
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。
随着高通量测序技术（NGS）技术的发展，使我们能够从全基因组水平来分析5’甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，由此能够发现很多传统的基因组学研究所不能发现的东西，这就是所谓的“DNA甲基化测序”！
DNA甲基化测序方法按原理可以分成三大类：
一、重亚硫酸盐测序；
二、基于限制性内切酶的测序；
三、靶向富集甲基化位点测序；
基于以上原理又有数种不同的测序方法，下面，就介绍10种DNA甲基化测序的常用方法及参考文献：
1) 重亚硫酸盐测序
该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。
【相关文献】
Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning
Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis
2）重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)
为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失，通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。
【相关文献】
Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging
3）限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)
该技术是指对基因组上CpG岛或CpG甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理，然后经重亚硫酸盐处理，最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。
【相关文献】
Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis
4）氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)
5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物，重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较，即可从单个碱基水平分辨5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。
【相关文献】
Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.
5）TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)
TAB-seq采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，进而可以从单个碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。
【相关文献】
Base-resolution analysis of5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome
6）甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)
MRE-Seq将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定CpG岛的甲基化状态。
【相关文献】
Genome-scale DNA methylation analysis
7）HELP-Seq
HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MSPI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。
【相关文献】
Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay
8）甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)
MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。
【相关文献】
Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells
9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)
MBD-CAP技术利用甲基化DNA能够结合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI来对甲基化的DNA进行免疫沉淀。与MeDIP技术相似，该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。
【相关文献】
High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer
10）基于探针的靶向富集技术
甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获CpG岛、基因启动子区域以及其他一些显著性甲基化的区域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有这种商品化的试剂盒。
最后，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的这项SMRT DNA测序技术采用动力学原理来直接检测甲基化的胞嘧啶。
其中三代测序技术针对真核中的5mc检测需要的深度较深，大概要250x,但是利用特殊的试剂会降低其深度。