基因敲除质粒的构建技术及方法

1.同源重组是一种准确修复破坏性的双链断裂的机制，核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间进行交换。基因靶向则是利用这一自然过程，运用一种特殊设计的含有同源序列的载体，将目标基因位点替换为同源序列。为了更了解这个过程，我们将介绍一个旨在敲除给定基因的第2外显子的实验。

设计你的目标结构。为了在细胞中重组，至少需要2 kb的同源序列，但6到14 kb的同源序列是靶向结构的典型特征。在图1所示的例子中，与目标基因外显子1和外显子3相对应的序列已克隆到载体抗生素抗性基因的任意一侧。为了避免选择那些结构随机整合到基因组中的细胞，像HSV胸苷激酶(HSV-tk)这样的阴性选择标记被包含在一个同源臂之外。当我们稍后选择细胞时，我们将首先对抗生素抗性基因进行阳性选择，然后对阴性选择标记进行反选择——这后一步将杀死许多随机整合了全部或大部分质粒的细胞。

2.呈递质粒给宿主细胞。重组后，目标基因的第2外显子将从染色体上移除，并被抗性基因取代。这样基因就被破坏或敲除了。

3.利用正负选择确定正确的重组细胞。重组是一个偶然事件，所以你必须选择而不是筛选已经发生重组的细胞。新霉素、嘌呤霉素和潮霉素耐药基因通常用于阳性选择。正选择标记对重组进行选择，而负选择标记对不适当的、随机的到不同位点的重组进行选择。正确重组的细胞不会包含负选择标记，但随机重组的细胞可能会将负选择标记重组到基因组。非同源重组的最终产物可以在正选择中存活，但对负选择是敏感的。

4.去掉阳性选择标记。由于抗生素耐药基因可以影响细胞的表型，研究人员通常在选择完成后使用Cre/Lox重组系统去除阳性选择标记。通过插入侧翼LoxP序列将抗性基因“包围”，再通过添加Cre重组酶将其去除(图2)。