腺病毒ADV构建技术原理

腺病毒(Adenovirus, ADV)是一种无包膜的线性双链DNA病毒,具有广泛的细胞和组织感染能力。感染过程剧烈,适于短时间内进行基因高表达的实验,与其它病毒相比,腺病毒最大优势在于插入片段较长,表达活性强。

  体外应用时,腺病毒载体转基因效率高(接近100%的转导效率),且可转导不同类型的细胞,对于大量难转染细胞的基因递送是一个很好的工具。但是,在体内应用时,由于腺病毒免疫原性强,感染剧烈,故常会引起动物局部组织炎症反应和机体免疫反应,对动物体征和实验结果的客观性造成影响。

腺病毒包装与纯化

  腺病毒包装中表达质粒与穿梭质粒共转染293T细胞,待细胞出现CPE状态后通过收集和过滤细胞裂解物而纯化。

  CPE(Cytopathic Effect):病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性,利用此种病变效应可进行病毒定量。

腺病毒滴度检测

  检测方法:酶联免疫法腺病毒滴度测定,根据计算感染后染成褐色的阳性细胞数,来计算病毒滴度

  实验原理:腺病毒感染的阳性细胞表达的衣壳蛋白被染成褐色

  检测方法:免疫显色方法。

  实验原理:通过抗5型腺病毒外壳蛋白的单抗与感染腺病毒样品的细胞结合,再用HRP标记的二抗与一抗结合,经显色液显色,被感染的细胞变成褐色,根据阳性细胞数,来计算病毒滴度。

腺病毒载体优势

① 表达快,腺病毒感染细胞后,1-2天即可表达
② 载体容量大,感染效率高,常用于感染难感染的细胞
③ 不整合到染色体中,无插入致突变性
④  具有嗜肝性,易于感染肝细胞,腺病毒的体内应用通过是用于感染肝脏

  不过由于腺病毒免疫原性高,对某些对外源刺激敏感的动物模型和组织中易造成炎症,体内应用需谨慎。

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