原代细胞纯化方法步骤

原代细胞分离的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法，下面我们就介绍酶解聚方法获得纯化的原代细胞。

（1）胰蛋白酶 纯化法

●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。

●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100 mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。

●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。

●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

●通过无菌不锈钢丝网（100～200 mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。

（2）胶原酶纯化法

●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。

●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。

●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

（3）Dispase纯化法

●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

●加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）

●在37℃孵育20分钟到几个小时。

●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。

●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。

●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

2.  分离细胞后，第一次传代需要注意的问题：

●传代培养时先观察细胞的活性。

●细胞的活率应该超过90%，密度控制在80%左右最佳

●对于无血清培养基，需要降低胰蛋白酶使用量。

（1） 移弃使用过的细胞培养基。

（2）使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA清洗细胞。在培养瓶背着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

（3）加入胰酶消化，消化细胞与细胞，操作手法，试剂的效价有密切的关系，消化时应注意观察细胞形态，如细胞变得椭圆透亮，并且可以观察到细胞与细胞间的间隙时，轻拍瓶身可以看见成流沙状，即可中止消化，消化时尽量减少对细胞的吹打。

（4）当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基中止消化，计数并再次培养细胞。

（5）对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。