编译：永稷，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
花是必要且不可或缺的植物器官，暴露于传粉昆虫和花食动物。但是有关花的化学防御却鲜为人知。
本研究表明：位于拟南芥5号染色体上的萜类合成酶和细胞色素P450编码基因（TPS11和CYP706A3）在开花期和花芽发育期与花器官的形成紧密共表达，其中TPS11可调控产生多种倍半萜烯类挥发性物质。
TPS11和CYP706A3在酵母真核表达系统和烟草植株中进行共表达结果表明：CYP706A3可激活TPS11，并进一步氧化其初级氧化产物。对cyp706a3及其35s突变体的柱头和可溶性代谢产物进行分析表明：CYP706A3会大大抑制倍半萜烯类化合物和绝大多数的单萜类化合物从花中的释放并在花器官中产生萜类氧化物。在花芽中，TPS11和CYP706A3的共同表达也会抑制挥发物的释放，产生可溶性性倍半萜烯类氧化物。对十字花科专性花食动物小菜蛾测定表明： CYP706A3表达及萜类氧化物积累的花芽对昆虫幼虫具有趋避效应。CYP706A3表达的花的微生物微生物组成也会发生变化。TPS11和CYP706a3在十字花科植物中会同时进化并在更高等的植物中形成很多挥发性功能的基因簇。
原名：A Promiscuous CYP706A3 Reduces Terpene Volatile Emission from Arabidopsis Flowers, Affecting Florivores and the Floral Microbiome
译名：混杂的CYP706A3减少了拟南芥花中的萜类挥发物释放，从而影响了花食动物和花卉微生物组
期刊：Plant Cell
IF：8.631
发表时间：2019.12
通讯作者：Danièle Werck-Reichhart
作者单位：法国斯特拉斯堡大学国家科学研究中心(CNRS)生物分子学研究所
1 CYP706A3和TPS11位于拟南芥5号染色体并在花中紧密共表达（阐述两个基因的发现及位置）
CYP706A3和TPS11是与细胞色素P450基因紧密共表达的萜烯合酶基因。采用BAR Expression Angler方法研究表明：当运用“Extended Tissue Compendium”数据集时，TPS11是CYP706A3最紧密共调控的基因(Figure 2A)。同样地，CYP706A3是P450基因中与TPS11最紧密共调控的基因。两个基因在空间发育中共表达，可在花期12-15的心皮中以及在芽顶端分生组织和花序顶端的样品中检测到最高水平的表达。在花期花的心皮中这些基因的共表达可通过RT-qPCR技术得到进一步的证实(Figure 2B)。器官基因组学进一步证实了该假设：CYP706A3和TPS11是拟南芥5号染色体上两个连接基因，被5kb的非编码序列所分隔且转录方向相反(Figure 2C)。这也就表明：这两个基因可能形成了一个更大的代谢基因簇的核心。两个编码s-腺苷甲基转移酶的基因经预测均位于质粒中，且表达谱与其他部位的TPS11和CYP706A3不匹配，其他基因不太可能参与萜烯类代谢途径(Figure 2C)。此外，没有与TPS11/CYP706A3位点紧密相关的代谢基因是BAR Expression Angler中绝大多数共表达基因列表中的一部分。很可能TPS11和CYP706A3形成了由两个共转录基因所组成的一个小的代谢基因簇。
图2. CYP706A3和TPS11位于拟南芥5号染色体并在花中紧密共表达。A. 与CYP706A3共调控的25个基因的表达热点图；B.植物(左)和花(右)器官中CYP706A3和TPS11的相对转录水平; C.5号染色体上CYP706A3和TPS11基因簇的图谱(上)和两个基因间的内含子/外显子和基因组距离的表达(下)。
2 在酵母系统中，CYP706A3氧化了主要的TPS11产物
为了验证两个基因簇基因之间的功能相关性的假设，在酵母系统中对CYP706A3对TPS11产物的作用活性进行测定，因为真核表达系统-酵母体系是细胞色素P450酶更为适宜的寄主系统。分别将TPS11和CYP706A3的全长序列在酵母系统中独自表达，分别对表达TPS11和CYP706A3酵母系统中8 d后的顶部空间的气体进行收集，在产物高峰期可检测到高达0.7 mg/L的TPS11主要产物(+)-α-barbatene(a) 和(+)-thujopsene (b)以及0.3 mg/L的CYP706 A3主要产物1。为了鉴定TPS11所产生的化合物是CYP706A3氧化的底物，以TPS11主要化合物(+)-α-barbatene and (+)-thujopsene接种到由CYP706A3所制备的微粒体质膜中，发现(+)-α-barbatene可被CYP706A3转化为纯化组分16中的产物1和3，以及之前在混合酵母培养系统中检测到的产物7和8。(+)-thujopsene以及纯的(-)-thujop sene可被CYP706A3转化为产物2和4。对这些化合物的保留时间和质谱结果与之前混合培养酵母系统中的组分11和16进行比对，结果发现由α-barbatene代谢产生的1和3具有不同的结构，而由α-barbatene代谢产生的化合物2和4的结构相似，很可能是倍半萜烯类化合物。核磁光谱鉴定发现CYP706A3的主要产物是(+)-1-oxo-thujopsene非对映体以及(+)-6-oxo-α-barbatene and(+)-6-OH-α-barbatene非对映体的混合物。通过高效液相色谱-质谱技术和液相双质谱技术对酵母表达系统顶部空间气体的样本进行纯化并在活体上进行接种分析。对组分11和16中的化合物1,2,3和4进行气质和核磁结构验证。纯化的组分11和16中分别含有CYP706A3所产生的罗汉柏烯和barbatene氧化物，将其接种到从CYP706A3酵母表达系统中分离得到的微粒体膜上。LC-MS/MS对最终的反应培养基提取物进行分析CYP706A3对thujopsene和barbatene氧化产物均具有活性。初级氧化产物(+)-α-barbateneoxidation(fraction 16)可被CYP706A3转化成为5,6,7和8，而(+)-thujopsene(fraction 11)而被CYP706A3可被进一步转化为9,10和11。这些次级代谢产物的保留时间和质谱表明绝大多数次级代谢产物可进一步被氧化。综上所述，这些数据表明CYP706A3对(+)-α-barbatene, (+)-thujopsene以及它们各自氧化产物具有连续的氧化活性，如图4所示。
图4 CYP706A3对植物TPS产物的催化反应。
3 CYP706A3在烟草中的表达说明其对TPS11产物具有更为广谱的显著活性
为了进一步确定CYP706A3在植物环境中对TPS11的活性，对相关基因在烟草叶片中进行瞬时表达。与TPS11酵母表达系统一致，TPS11烟草表达系统的顶部空间气体中叶可以检测到相同比例的倍半萜烯类物质(Figure 5A)。CYP706A3与TPS11在烟草中的共表达所产生的CYP706A3主要产物1,2,3和4，在酵母共表达系统中也均可检测到，随之而来的减少了所有TPS11产品的排放，尽管程度不同(Figure 5A-B)。萜烯结构对于多环类化合物barbatene, thujopsene, chamigrene,cuprenene, isobazzanene and acoradiene释放的降低多于单环和环状化合物，如三聚氰胺、倍半烯、姜烯、法尼烯。TPS11化合物释放的降低并不是由于其与另一个蛋白的共表达而降低了TPS11化合物的生产潜力。总而言之，TPS11和CYP706A3在烟草中的共表达证明植物中barbatene和thujopsene的形成依赖于CYP706A3，也表明CYP706A3的混合使得绝大多数TPS11产物被氧化成为更多体积庞大的多环倍半萜烯类化合物。
图5 在本氏烟中瞬时共表达显示CYP706A3对多个TPS11产物的活性。
4 CYP706A3将花中的倍半萜烯和单烯物质氧化为萜类物质
运用CYP706A3及其35s:cyp706A3突变体对拟南芥花中TPS11和CYP706A3的相关功能进行研究。构建CYP706A3两个独立的T-DNA群体，一个是启动子cyp706a3-1，另一个是编码序列cyp706A3-2，从而导致cyp706A3在花中转录缺失。通过用花椰菜花叶病毒（CaMV）35S：CYP706A3构建体转化Col-0产生异位过表达细胞系。对野生型和突变拟南芥植株的挥发性物质进行比较发现CYP706A3缺失会导致TPS11释放产物的急剧增加(Figure 6A)。更加令人惊奇地是，CYP76A3的缺失也会增加由TPS21和TPS24所调控的其他倍半萜类和单萜类挥发性物质的增加。总而言之，突变株所释放的挥发性有机物质的含量超过两倍(Figure 6B)。同样地，CYP706A3过表达株系所释放的挥发性有机物质急剧减少。突变株中不同化合物更加精确的定量表明所有的挥发性萜类物质均不会被CYP76A3以同样的效率进行氧化，这与烟草突变株中所得到的结果相一致。此外，在CYP706A3突变株中barbatene氧化物1和3以及thujopsene氧化物2和4的含量与野生型相比大大减少。这些初级氧化产物在CYP706A3过表达株系中不再增加，这与活体实验结果相一致。对CYP706A3突变株顶部空间所收集气体的分析更进一步发现CYP706A3对TPS21和TPS24所调控产物的复杂的氧化活性。通过TPS21或TPS24酵母及烟草共表达系统对CYP706A3的活性进行了进一步的验证，及共表达系统中萜类物质的混合产物显著减少。CYP706A3对TPS21产物的氧化活性导致了酵母及烟草系统中氧化产物的释放，这通过E-β-caryophyllene接种试验得到证实。相反，在TPS24和CYP706A3共表达系统中未检测到挥发性有机物质。CYP706A3会将TPS单萜类产物氧化为未知的氧化产物，绝大多数CYP706A3氧化产物均可溶而储存在植物组织中。
图6 CYP706A3突变体中释放的挥发性有机化合物。
4 CYP706A3蛋白的结构基础、对昆虫产生了趋避作用以及对花中细菌群落的影响
与大多数其他P450酶相比，CYP706A3表现出不同寻常的混杂性。它的作用在倍半烯基和单萜类化合物，此外，还可以对相同的底物产生连续的氧化反应。为了理解这种混杂的结构基础，使用多模板方法生成了酶的3D同源性模型，并基于序列同一性和通过HMM配置文件搜索远距离同源物来迭代搜索模板。评估并比较了从检测到的模板的各种组合重建的CYP706A3模型。最佳同源性模型产生了最高的QMEAN4评分，是从三模板构建中获得的。通过计算发现，该结构展示了两个主要的通道，一个显着疏水的通道连接到膜，另一个不那么疏水的指向膜-水界面（图9A）。CYP706A3血红素口袋显示出一个很小，受约束且基本疏水的空腔（图9B），该空腔主要由无极性残基（Ile130，Ala383，Val382，Val387，Gly318，Leu386）组成，除了第一冠中仅有的极性残基Thr322在血红素平面上方（图9B和C）。空腔的上部也主要是疏水的（Val497，Ile496，Trp131，Leu317和Leu229），带有一个带电荷的残基（Asp321）。总之，这些特性使活性位点很好地适应萜类化合物（如倍半萜），如血红素附近的（）-thujposene和（）-α-barbatene的良好模型拟合说明了这一点（图9C-9D）。在该结构模型中不同倍半萜烯的分子对接产生了令人惊奇的同质性分布，在大多数情况下具有与观察到的新陈代谢相对应的主要的或唯一的排名最好的基因簇。thusjopsene被发现通过双键堆叠在血红素卟啉环上，与主要氧化产物1-oxo一致，烯丙基（C11，图9E）和乙烯基位置（C1）的铁碳距离最短-thujopsene。对TPS11/CYP706A3在花对传粉昆虫潜在的防御作用进行了研究。探索到底是TPS11单独表达所释放出的挥发性有机物质还是TPS11和CYP706A3共表达系统所释放出的挥发性有机物质对昆虫产生趋避作用。对CYP706A3的产物进行分离纯化鉴定，结果表明未氧化的倍半萜烯类化合物会吸引昆虫，而倍半萜烯类物质氧化后的产物会抑制昆虫。与该趋势一致的是，昆虫更喜欢TPS11表达所产生的产物而非TPS11和CYP706A3共表达所产生的混合产物，从而确定氧化后产物的驱虫活性。就CYP706A3表达对花微生物群落的影响进行研究。对拟南芥野生型、CYP706A3以及35S:cyp706A3三种植物材料的花的细菌DNA进行提取并测序。基于DNA序列的相似性进行分类单元的确定，并进一步进行丰度、多样性和微生物组成的比较研究。随机森林分析表明野生型花的细菌分类单元与两种突变体的分类单元不重叠(Figure 10B)。用最小二乘判别分析进一步对每种花的分类单元进行检测，结果表明不同类型的花的微生物组有所不同(Figure 10C)。为了明确每个花系的OTUs，我们进行了单变量分析(图10D)。结果显示，47个OTUs在三种植株花中有显著性差异的定殖模式。具体来说，有20和25个otu 显着富集了定植于CYP706A3 -2和35S:CYP706A3的花，其中有20个在野生型上几乎检测不到或缺失。相比之下,19个19个out在野生型花中被发现,但分别有14个OTU和6个OUT在cyp706a3-2和 35S:CYP706A3的花中几乎检测不到或缺失。这些结果表明：CYP706A3所氧化产生的代谢产物在特异性微生物在拟南芥花中的定殖中具有重要的作用。
图9 CYP706A3活性位点的三维结构模型及相关底物的比较对接。
图10 CYP706A基因簇化产物影响了花的驱虫行为和花的微生物种群。
本研究数据表明，依赖于CYP706A3萜类氧化物质对花微生物具有选择性。细菌丰度、多样性和组成的分析表明每个花基因型都具有特殊的微生物群体(Figure 10C)。cyp706a3和 35S:CYP706A3突变寄主的细菌群体OUT较野生型丰富，这一结果与萜类氧化物通过减少细菌定殖，从而减少野生型植株花多样性相一致。判别分析结果可视化清楚的展示了花基因型与群体的相关性。不同基因型植株微生物群体组成的差异提高了所有OUT不会被相同的影响的可能性。因此，我们发现植物对其微生物的影响具有特异性。例如，35S:CYP706A3突变体植株中所发现的高丰度的OTUs中，532个OTUs与假单胞菌的亲和性较高。与这一结果相一致的是，在倍半萜类物质积累的茄科植物中也存在假单胞菌。该属微生物能够促进萜类化合物的氧化。相反地，本研究发现定殖于野生型拟南芥中花中的特异性OTUs在cyp706a3和35S:CYP706A3突变体花中缺失。
总的来说，本研究结果表明TPS11和CYP706A3基因簇有助于调控拟南芥花上的细菌群体。该结果与早期挥发性有机化合物形成了细菌群体的多样性和组成这一结果相一致。最新研究表明花微生物组的移除会导致花中萜类物质的释放以及花代谢的变化。除此之外，表面细菌改变了花芳香气味的释放。反之亦然，花挥发性物质也会影响微生物在花中的定殖。比如拟南芥中TPS21所调控的石竹烯，其会保护植物不被细菌性病原菌Pseudomonas syringae所侵染。细菌亚群的器官特异性生态作用以及它们对花卉健康的优势仍有待确定。此外，CYP706A3对底物和产物的选择性对相关微生物群体的影响仍需进一步的研究。多种生物的交互作用的复杂程度与花相关微生物组以及花入侵者之间紧密相关。
该篇论文创新点在于对“植物-植物微生物-花食昆虫”三者的互作进行了研究，通过代谢组学、代谢物表达调控、微生物组学和杀虫活性等试验，对植物花对取食昆虫的这一现象背后的机制进行了深入的阐述。特别突出了微生物在植物表型中的重要作用，为利用微生物进行作物改良、植物保护、农业生产及农业可持续发展奠定了基础，是微生物组与植物互作研究中的典范，值得借鉴。
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