科研 | PNAS：转录组研究揭示了LncRNA参与疫苗接种免疫后的多条免疫应答通路
编译：雪源，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
疫苗是医学领域最伟大的成就之一，它大大降低了人类许多重大传染病的死亡率和发病率。然而对疫苗介导的保护机制的理解仍然不完善。新兴的系统疫苗学为测试和开发疫苗提供了重要的新见解和新工具，并已研究出了几种疫苗的分子保护机制。长链非编码RNA（lncRNA）在多种生物过程中起着重要作用，但它们在疫苗接种后诱导免疫中的作用尚未见报道。本研究选取了来自17个志愿者团体在接种黄热病和流感疫苗后的2,059个血液微阵列转录组样本进行分析，筛选出疫苗的抗体反应有关的lncRNA。研究发现lncRNA可以通过不同途径参与疫苗引发的免疫反应。其中，lncRNA FAM30A在B细胞中高表达，并能参与其基因组附近的免疫球蛋白基因的表达。同时这些lncRNAs的变化与鼻内接种减毒活流感疫苗的儿童RNA测序（RNA-seq）结果的变化趋势一致，表明不同的疫苗接种具有共同的免疫应答途径。总之，这些发现表明lncRNA对疫苗接种诱导的免疫应答具有重要的作用。
论文ID
DOI号：10.1073/pnas.1822046116
实验设计
结果
本研究分析了接种黄热病疫苗（YF-17D）或灭活流感疫苗（IV）的17组群参与者的血液和外周血单核细胞（PBMC）表达数据。其中大多数参与者有疫苗接种前和接种后的抗体滴度数据（图1A）。这些样品的RNA杂交微阵列的原始数据保存在GEO和ArrayExpress数据库中。数据预处理之后，进行了四种类型数据集的分析来鉴别疫苗诱导的免疫应答（图1B）。
为了鉴别lncRNAs，各微阵列的序列对比到人类基因组HG38并重新注释到GENCODE_v_24基因组特征库。所有微阵列包含的不同类别lncRNAs如图1 C所示。由于每个微阵列平台都有特定基因组，因此本研究表征了各平台的交叉点，即使用所有微阵列平台中同时检测到的lncRNAs。其中IV和YF-17D接种后分别共有204和91个lncRNA。
图1. 17个组群疫苗接情况Meta分析的实验设计。（A）抽样方案的图示。在IV或YF-17D疫苗接种后第0, 1, 3, 7, 14和28天收集血样。圆圈中的数字表示处理后从每个群组中使用的样本数。IV疫苗组中显示了流感季节季节，如07代表2007/2008年，08代表2008/2009年，以此类推。（B）本研究中计算分析的总结。用商业微阵列平台评估血液样本的转录组。在对不同组群样本进行重新映射后，进行差异表达分析，抗体滴度相关性分析，邻近基因的相关性和共表达分析。（C）每个微阵列平台中lncRNA类别的表征。
IV疫苗接种后1、3、7或14 d与基线相比有几十个lncRNA表达上调或下调（图2 A）。在在疫苗接种7d后， TNFRSF17、GGH和CD38基因在多数样本中表达上调（图2 B和C），IV接种后1d与单核细胞、细胞周期、TLR信号传导、抗原呈递和IFN反应相关的途径被表征，而在接种后7d后在大部分样本中检测到与B细胞、激活的CD4+ T细胞相关的途径被表征。
研究还用随机效应Meta分析以确定整IV和YF-17D接种后lncRNAs的表达差异。结果发现lncRNA在接种疫苗后表现出微妙但显著的变化。其中IV接种1d后MIAT (P = 3.05×10 -6)和MCM3AP-AS1(1.06×10 -5)显著下调（图2 C），而在接种3d和7d后LINC01133（P = 0.000917）和DANCR（P = 1.05 × 10−8）显著上调（图2 C））。IV接种7d后所有的样本中蛋白质编码基因TNFRSF17表达均显著上调（P = 1.787×10 -11）（图2 C）。YF-17D接种后，差异表达的lncRNA包括AATBC（P = 0.0008938, 7d），MAPKAPK5-AS1（P = 0.0005284, 7d）和LRRC75A-AS1（P = 0.000339, 3d; 2.524×10 -8, 7d）。接下来，作者又用Blueprint的RNA-Seq数据研究了这些lncRNA在不同免疫细胞中的表达（图2 D）。结果发现DANCR在淋巴来源免疫细胞中特异性表达，，而lncRNA AATBC在单核细胞中特异性表达。
图2 IV接种后的转录组学分析。在一个或多个数据库（x轴）中差异表达的lncRNA（A）和蛋白质编码基因（B）（y轴）的累积总和，Limma分析结果P < 0.05时表示差异表达。（C）重复差异表达的代表性lncRNA和TNFRSF17的森林图。红色垂直线和阴影区域分别代表log 2倍数变化和95％置信区间。（D）人免疫细胞基因表达热图，参考基因（FPKM）设置在0附近，方法参照文献28。列代表样本;行代表基因。
本文还对IV和YF-17D接种后与抗体反应相关的lncRNA进行了筛选。结果发现lncRNA FAM30A（KIAA0125）与IV接种高度相关（图3）。FAM30A位于14号染色体上是嵌入在免疫球蛋白（Ig）重链（IgH）基因区段的反义方向的IncRNA。在接种疫苗7d后FAM30A的表达与抗体滴度呈显著正相关（图3 A）。与其他免疫细胞类型相比，B细胞中观察到更多的FAM30A表达（图3B）。同时抗体分泌细胞（ASCs）中FAM30A的表达也显著增加，这也部分解释了微阵列分析中观察到的FAM30A表达和抗体滴度之间正相关性。为了检查共调节的证据，作者又比较了FAM30A基因组附近的4个IgH区段的基因的表达水平来揭示了FAM30A与IgH基因区段正相关性（图3 C），表明FAM30A潜在顺式调节IgH区段表达和功能的作用。
图3 FAM30A表达与抗体产生和IgH基因区段相关性。（A）不同样本（y轴）FAM30A和抗体滴度之间的相关性。红色垂直线和阴影区域分别表示相关性概要和95％置信区间（x轴）。（B）根据参考文献28, B细胞中FAM30A的表达较高。（C）IV接种7 d后FAM30A与IgH基因座内基因区段之间的倍数变化相关性。每个圆圈代表不同IV样本中的Pearson相关系数。Meta分析P值在样本下方标识。
4. lncRNAs的标准化表达分析
基因共表达分析有助于鉴定疫苗接种后lncRNA和mRNA之间的新功能。因此本研究又对IV接种后7 d与接种前的样本进行CEMiTool运算，然后spin glass法将所得结果构建互作网络，共得到16个互作网络子集（图4 A）。这些网络子集富集了不同免疫细胞和过程，如单核细胞（CM1），血小板活化（CM4），T细胞（CM5），IFN反应（CM6），B细胞（CM7）和自然杀伤细胞（CM9）（图4B）。然后用网络子集作为基因组进行富集分析，再以基线log 2FC为基准对不同子集样本log2FC的平均值进行比较，揭示等效等效比较中不同样本之间的互作网络。例如，CM1，CM3和CM6基因在疫苗接种后1 d高表达，而CM7和CM8基因在疫苗接种后7 d高表达（图4C）。
图4 IV接种后共表达网络。（A）通过CEMiTool分析构建的共表达网络。使用spin glass聚类算法进行预测。图表颜色基于软件分配，每个子集子集用一个矩形表示，矩形中包含子集名称、基因数和lncRNA的数量（括号中）。（B）使用血液转录模块（BTM）对选定子集进行代表性分析。（C）使用网络子集进行基因集富集分析（GSEA）。行代表网络子集，列代表疫苗接种样本的平均倍数变化，热图表示FDR <0.05阈值下的子集标准化富集评分（NES）。（D）与CM5中PRKCQ-AS1连接的一些基因。矩形的颜色深浅代表疫苗接种后1 d与基线的log 2倍数变化。
结论
多种过程的稳态调节都涉及对疫苗接种和感染的免疫应答。本研究表明，lncRNA参与其中一些过程有关。YF-17D疫苗接种7 d后血液中主要表征先天抗病毒IFN反应，而IV疫苗主要表征分泌抗体的B细胞。这些差异可以解释每种疫苗介导的不同lncRNA的反应。但本研究仍然筛选出了一些共同激活的lncRNAs，它们可能是疫苗成功诱导免疫应答的潜在共同途径。本研究表明FAM30A可能与B淋巴细胞的生物学和IV引起的抗体反应有关，作者建议FAM30A可用于快速监测流感疫苗接种诱导的抗体应答。
评论
本文首次关注了lncRNAs在疫苗诱导免疫过程中的作用。本文提出lncRNA在疫苗诱导的免疫应答的过程中可能起特定的作用。作者还根据Meta分析结果创建了一个在线数据库，用户可以在其中提mRNA和lncRNA进行可视化查询，希望这一综合的在线资源能够帮助血液转录组学研究人员对疫苗研究相关假设作出快速评估。