编译：独世，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
动物肠道中的微生物群落由多种物种组成，影响了宿主的发育，健康和疾病。由于肠道群落的复杂以及对其原位表征存在一定的难度，影响微生物组成的因素仍然未知。此外，对于多数多物种种间合作来说，尚不清楚是否可以基于成对物种相互作用来预测其物种组成，或者是否需要更高阶的相互作用来解释新出现的组分。
为了解决这个问题，本文研究了斑马鱼幼体中的共生肠道微生物，最初其肠道是无菌的，后续引入可控的细菌物种组合。通过使用解剖和平板分析法，我们证明了由一到五个细菌物种组成的群落的构建，且两种物种竞争的结果未能预测更复杂群落中物种的丰度。当存在多种物种的情况下，细菌间的相互作用变弱，这表明脊椎动物肠道中的高阶相互作用稳定了复杂的群落。该研究阐述了脊椎动物肠道环境中的各种微生物群落组成的规律，为操控此类细菌群落达到治疗的目的提供了一定的理论依据。
原名：Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome译名：斑马鱼肠道微生物组中的高阶相互作用抑制了微生物之间的成对竞争通讯作者：Raghuveer Parthasarathy本文以野生型（ABC x TU株）斑马鱼（Danio rerio）幼体为研究模型。在受精后大约7小时，用抗生素，漂白剂和碘溶液洗涤胚胎，然后将其移至装有15 ml无菌胚胎培养基的组织培养瓶中，每个幼体约1 ml无菌溶液，然后将培养瓶放置于28℃恒温环境中。本研究中使用了从斑马鱼肠中分离出来的五个细菌菌株，即气单胞菌菌株ZOR0001，门多萨假单胞菌ZWU0006，醋酸钙不动杆菌ZOR0008，肠杆菌菌株ZOR0014和邻单胞菌菌株ZOR0011菌株，并对它们进行了荧光标记以表达绿色荧光蛋白（GFP）和dTomato。在受精后第5天，以106 CFU/ml的浓度将细菌接种到组织培养瓶中。对于涉及2、4和5个细菌物种的每个竞争实验，将相同浓度的细菌接种到组织培养瓶中。接种后然后将培养瓶放置于30℃恒温环境中。在受精后第7天，将斑马鱼幼体解剖以确定细菌种类的肠道丰度。将均质的肠溶液稀释10倍和100倍，然后将100ul体积的稀释液铺在琼脂平板上。使用胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板和HiChrome琼脂（Sigma-Aldrich）平板分别对单/双接种和两种以上的接种进行计数（荧光）。为了确定体外竞争系数，将五个细菌的所有不同的成对组合在LB培养基中过夜培养，在第二天，将以107或10 6稀释培养物接种于平板并计数。斑马鱼幼体（图1A）是无菌的，在受精后第5天将细菌添加到装有幼体的培养瓶中，并用所需的微生物物种组合进行接种。大约48小时后，对鱼实施安乐死，并通过解剖将其肠切除。将肠及其内容物均质化，稀释并涂布在显色琼脂上。利用五个候选细菌物自身代谢产生的酶与培养基中相应显色底物反应显色的原理来检测微生物，从而可以确定CFU的数量，定量肠道中细菌的绝对丰度（图1B）。本研究选择的五个物种是斑马鱼肠道中常见的代表属。正如预期所示，它们与斑马鱼肠道微生物组高度相关，因此每个物种都以单联体形式存在。作为接种在无菌幼体肠道中的唯一物种，其牢固定殖于幼体肠道中，丰度可达103至104，对应的体内密度约为每毫升109至1010个细菌（图1C）。
图1 本研究选择的五个共生物种是幼体斑马肠的牢固定殖。（A）受精后第7天斑马鱼幼体的肠道（虚线范围内）。比例尺，500微米（B）显色琼脂平板显示了五个候选物种的菌落（醋酸钙不动杆菌ZOR0008，乳白色不透明；气单胞菌菌株ZOR0001，红紫色；肠杆菌菌株ZOR0014，蓝色；邻单胞菌菌株ZOR0011，深紫色；门多萨假单胞菌ZWU0006，无色半透明）。（C）与宿主单联定殖时，每种五个细菌物种的每个斑马肠的丰度，以平板肠内容物的CFU数量评估。每个圆圈数据点都是来自单份斑马鱼肠道样品的CFU值（从左到右分别为13、17、15、8和10），均值和标准偏差由方形标记和误差线表示。AC，醋酸钙不动杆菌ZOR0008；AE，气单胞菌菌株ZOR0001；EN，肠杆菌菌株ZOR0014；PL，邻单胞菌菌株ZOR0011；PS，门多萨假单胞菌。
1 双联实验中的成对相互作用
本研究首先检测了两个物种所组成的的10种可能的共培养物，可以在没有更高阶相互作用的影响下评估成对相互作用。图2A和B分别显示了在存在其他四个物种的情况下，醋酸钙不动杆菌ZOR0008以及肠杆菌菌株ZOR0014的每个物种在每个肠道样品中的CFU数量。当存在任何其它物种时，醋酸钙不动杆菌的丰度与其单联的丰度相似。相反，与邻单胞菌菌株ZOR0011或门多萨假单胞菌ZWU0006共培养时，肠杆菌菌株ZOR0014的平均丰度与其单联的丰度相似；与醋酸钙不动杆菌ZOR0008共培养时，其丰度约低10倍，与气单胞菌菌株ZOR0001共培养时，则降低2个数量级以上，意味着强烈的负相互作用。参数化物种之间相互作用的强度必然是模型依赖于一种物种的丰度与另一种物种的丰度之间关系的功能形式。研究表明，我们得出的关于相互作用强度的变化的结论在各种模型上是基本相似的，特别是当存在多个物种时。我们首先考虑了一个系数
它在对数丰度中是呈线性的，表征了物种j对物种i的影响：
其中Pi表示物种i的丰度，上标I或II表示单或双联实验。这种形式是由于肠道细菌丰度的分布大致呈对数正态分布，而添加的物种能够引起数量级的变化（图2A和B）。在竞争性Lotka-Volterra模型中，可以将
值推导为相互作用参数，以修改为对数丰度。从定性的角度来看，正旳
值表示存在物种j时物种i的丰度增加，负的
值表示存在物种j时物种i的丰度下降。从测量的细菌丰度集合中进行二次采样可得出估计的相互作用参数的均值和标准差。
图2 较强的成对负相互作用主导了双联实验。每份斑马鱼肠道样品中的醋酸钙不动杆菌ZOR0008（A）以及肠杆菌菌株ZOR0014（B）在单联（灰色）和双联（蓝色/绿色）中的丰度。每个圆圈数据点都是来自单份斑马鱼肠道样品的CFU值（从左到右分别为13、21、19、20、27 [A]和 15、19、22、18和23 [B]），方形标记代表均值，误差线代表标准偏差。（C）成对相互作用系数
，表征物种j对物种i的丰度的影响。黑色轮廓表示与零相差超过三个标准偏差的成对相互作用系数。（D）每个双联组合中每个斑马鱼的平均细菌接种量，用log10（总CFU）表示。对角线上的值是五个物种中每个物种的单联接种量。AC，醋酸钙不动杆菌ZOR0008；AE，气单胞菌菌株ZOR0001；EN，肠杆菌菌株ZOR0014；PL，邻单胞菌菌株ZOR0011；PS，门多萨假单胞菌。
我们在图2C中绘制了由等式1定义的
，该值由所有物种配对产生的双联数据计算得出。我们仅使用两种细菌均可在肠道中检测出的相关数据来确定
值时，这样一种物种的丰度变化可以确定地归因于肠道内另一种物种的存在。系数C值的不确定性是通过自助子采样法估算的。相互作用主要是负面的。20个系数值中有13个系数值与零之间的差超过三个标准偏差，这表明相互作用强度为零或符号相反的可能性非常大，又可能小于0.001。对于所有双联实验，总细菌接种量（例如细菌丰度之和）是相似的，这表明相互作用的影响并非源于肠容量的变化（图2D）。
尽管斑马鱼肠道的物理和化学环境可能与标准生长培养基的试管非常不同，但我们在体外竞争实验中检测了每对物种的丰度，并在溶原性肉汤（LB）培养基过夜培养，平板计数得出CFU。正如预期的那样，从体外实验计算得出的相互作用系数与体内测量的相互作用系显著不同（图3B）。
图3 五个物种实验中的成对交互作用较弱。（A）当五个物种同时接种（灰色）时或每四个物种同时接种（绿色）时，肠杆菌菌株ZOR0014在每份斑马鱼肠道样品中的丰度，其中不包含的物种显示在横坐标轴上。每个圆圈数据点都是来自单份斑马鱼肠道样品的CFU值（从左到右分别为40、12、12、11和9），方形标记代表均值，误差线代表标准偏差。（B）当存在5种细菌时，成对相互作用系数CV的矩阵。黑色轮廓的系数与零的差超过三个标准偏差。（C）从4种到5种实验推断出的成对相互作用系数与从1种到2种实验推断出的成对相互作用系数。颜色为每个交互对标记种类i。（D）从幂定律相互作用模型针对1到2种（正方形填充标记）和4到5种（正方形标记）实验的不同指数值计算的最小相互作用系数。
2 多物种群落中的成对相互作用
为了评估我们在两种物种实验中发现的强竞争相互作用是否在多物种群落中得以保留，我们在幼体肠道分别接种四、五种细菌物种，同时定量了成对相互作用。我们采用了一种类似于宏观生态学研究中经常使用的“留一法”的方法来评估
值，例如在经典实验中，潮汐池中的单个物种被去除，剩余物种的丰度被用来评估物种间的相互作用。在这里，我们进行了共接种实验，分别排除了五种细菌之一，并将其它四种细菌在肠道中的丰度与在五种细菌共接种实验中测得的相比。
在大约每10只鱼中，我们对四种细菌进行了五种不同的共接种组合。与接种了缺失物种j的四个物种组合相比，接种五个物种的幼体肠道中的物种i的丰度差异可以衡量物种j在多物种环境中对物种i的影响。例如，在分别缺乏醋酸钙不动杆菌ZOR0008、气单胞菌菌株ZOR0001、门多萨假单胞菌、单胞菌菌株ZOR0011的接种物中的肠细菌菌株ZOR0014丰度以及五种细菌共接种中的肠细菌菌株ZOR0014丰度如图3A所示。与双联实验相反（图2B），我们看到肠杆菌菌株ZOR0014的均值或分布均未显示出较大的丰度差异，这表明在多物种群落中存在非成对的交互，即更高阶的交互。同样，有多种选择可以量化多物种系统中的相互作用系数。我们首先认为相互作用系数修正了平均对数丰度，类似于等式1的成对模型
图3B中显示了本文中获得的相互作用系数是不同的，并且通常比在两个物种情况下得到的弱得多（图2C）。只有三个相互作用与零之间的差异超过三个标准差。令人惊讶的是，所有这三个相互作用都是正的。图3C绘制了多物种相互作用系数
对两种相互作用系数
，进一步说明了两个物种和多物种之间的相互作用向更弱和更积极的相互作用的转变。
3 一般模式下的互作
如前所述，在对数丰度上线性相加的模型只是有限数量的选择之一，而且可能无法充分反映肠道内相互作用的复杂性。先前研究斑马鱼幼体肠道特定微生物群落空间结构的实验表明，诸如气单胞菌菌株ZOR0001、肠杆菌菌株ZOR0014和门氏假单胞菌形成了致密的三维聚集体。聚集体的大小和位置以及这些聚集体中特定的或其他位置的细胞位置可能以群体大小亚线性，线性或超线性的方式影响它们的相互作用。先前的工作还建立了肠道细菌影响肠道的机制，强调了其功能形式未知的许多可能的间接相互作用机制之一。此外，其他研究表明，不同的物理和化学交流方式可能导致不同物种之间的远程相互作用。为了解决这些可能性，我们使用更通用的幂律模型评估了物种之间的相互作用，其中物种之间的相互作用在效应物种的丰度中可能是非线性的。在这里，相互作用系数
取决于效应物物种j的丰度的幂α，我们在幂为0.1到2的范围内进行评估，涵盖了亚线性和超线性相互作用。公式1和2的修改版本如下：
从中我们可以分别评估和。注意，在等式3和等式4中α=1，即丰度呈线性的相互作用只是人口模型中常用的竞争性Lotka-Volterra模型的稳态行为。在许多情况下，二联的成对相互作用是呈强烈负相关的，而多物种相互作用则较弱。通过研究在不同的α值下呈负相关最强的
和
的趋势（图3D），这表明对于所有α值，最强的
都比最强的
弱得多，这表明我们的结果对选择模型具有鲁棒性。
4 五个物种共存
接着，我们考虑所有五个细菌物种的共接种情况。200多种鱼的实验表现出了丰度的多样性，在图4A中描绘为每种幼体肠道中每种物种的相对丰度。结果表明多个物种能够共存，且共存物种的中位数为4（图4B）。平均细菌接种量及其分布（图4C）与单联和双联实验以及之前讨论的四种细菌共接种实验的平均值和分布相似。我们计算了每种细菌物种的预期丰度，前提是控制五种群落的相互作用仅仅是控制双联的成对相互作用的线性组合
。我们评估的任何加性模型都可以扩展到物种组合。考虑到上面关注的模型，利用相互作用系数修改对数丰度，在存在另一个物种j的情况下，物种i的预测丰度由下式给出：
其中上标V表示五种共接种实验。根据每个相互作用系数的测得分布和单缔合的平均丰度进行采样，可以计算出预期值的分布。图4D中绘制了五种细菌在五种细菌共接种实验中丰度的测量值和预测值分布。每个物种的测量值分布非常相似。相反，丰度预测值的分布因物种而异。对于两个物种，即醋酸钙不动杆菌和门氏假单胞菌，观测值和预测值分布的均值相似。相比之下，对于其他三个物种，观测值和预测值之间存在很大的差异，成对预测至少比观察值低一个数量级。对于肠杆菌菌株ZOR0014尤其是邻单胞菌菌株ZOR0011来说，由于强烈的成对负向相互作用，我们预计他们会在大部分鱼类肠道中消失。但实际上，这两个物种都是常见的且丰度较高的。类似地，在不考虑其丰度的情况下，我们可以从模型中提取每种细菌的预测出现频率，即该肠道中细菌种群为非零的鱼的比例。研究发现，对邻单胞菌菌株ZOR0011和肠杆菌株ZOR0014预测的频率远低于实验观察到的结果（图4E）。通过测量肠道中细菌种群的绝对丰度，研究直接评估了种间相互作用的直接评估。例如，在人类肠道微生物组研究中比较常见的是基于测序的方法来提供物种丰富度的相对度量，即每个分类单位占总接种量的比例。相对丰度之间的相关性通常被用作相互作用强度的量度。计算用所有五个细菌物种接种的鱼中每对物种相对丰度的Pearson相关系数（图4F），我们发现了与绝对丰度变化推断的相互作用矩阵（图3B）截然不同，其中存在强负相关。皮尔逊相关性与我们直接测量的相互作用系数之间存在差异的原因可能有很多。Pearson r必须将成对物种之间的相关性归因于该成对物种独立于其他物种的动态的指示，这与总细菌接种量的总体变化相混淆，并且最重要的是必须对称（
），而从绝对丰度数据推断出的
值明显不对称（图2C和3B）。
图4 共接种五种细菌的实验中肠道细菌群落比基于两个物种的成对相互作用所预测的更加多样和丰富。（A）堆叠条形图显示了共接种五种细菌时肠道中五种细菌的相对丰度。每条都代表单份肠道样品，按总细菌接种量排序。（B）直方图展示了共接种五个物种时肠道中的细菌总数。（C）总细菌接种量对接种菌种数量的函数。每个圆形数据点都代表单份鱼肠道样本（从左到右分别为63、232、187和202）的CFU值，方形标记和误差线指示分别嗲表平均值值和标准偏差。（D）当所有五个物种同时接种时，斑马鱼幼体肠道中每个细菌物种的预测（蓝色Xs）和实测（棕色圆圈）丰度。预测基于交互模型，该模型使用成对的系数
在对数丰度上呈线性关系。实心方形标记表示分布的平均值和标准偏差（不包括空计数）。虚线表示25个细胞的实验检测极限。实验数据总共来自202份鱼肠道样品，而预测分布来自250个相互作用系数分布的样本。（E）五种细菌共接种实验中五种细菌在肠道的出现频率的观察值与预测值之间的关系。（F）五种细菌共接种实验中，基于物种对的相对丰度计算出的Pearson相关系数。AC，醋酸钙不动杆菌ZOR0008；AE，气单胞菌菌株ZOR0001；EN，肠杆菌菌株ZOR0014；PL，邻单胞菌菌株ZOR0011；PS，门多萨假单胞菌。
我们对相互作用强度的量化依赖于最少的假设，这些假设可以作为加性模型的一般测试。交互强度必定是特定模型的参数。我们使用的模型中，一个物种的对数转换种群是其他物种的对数转化种群的线性函数，而更通用的幂律模型涵盖了种群数量的亚线性和超线性依赖性。我们有充分的理由怀疑此框架。首先，平衡状态值可能无法很好地描述肠道菌群。其次，这些模型缺乏空间结构信息。斑马鱼肠道中一种或两种物种的体内显微镜检测结果强调了以下两个问题：种群非常活跃，具有快速增长和随机驱逐的能力；相互作用可以通过复杂的肠道机制来介导；聚集和定位行为是具有物种特异性的。然而，成像为这些粗略模型提供了依据。先前基于显微镜的研究表明，细菌增长率很快，大约12小时内达到承载能力，远低于此处考虑的48小时评估时间。由于几乎在所有细菌物种中都观察到强聚集作用，因此，多数聚类中的绝大部分单个细菌都不会直接与其他物种相互作用，从而导致种群大小呈次线性的相互作用，表现出对数或1次幂定律的功能形式。此外，可以将随机动力学映射到族群的的鲁棒平均属性上。因此，使用简单的模型并将其参数表征为有效行为的近似值是合理的。我们注意到这些问题也会影响更常用的模型，例如族群数量规模呈线性关系的标准竞争性Lotka-Volterra模型。尽管缺乏有关其真实性的信息，但这些模型通常应用于肠道微生物组数据，并用于推断相互作用参数。相互作用的幂律模型为我们结论的普遍性提供了最有力的指示。在从高度亚线性（0.1）到超线性（2.0）的一系列相互作用形式中，当存在4种或5种细菌时时，强烈的竞争相互作用会减弱，这表明肠道细菌之间存在更高阶的相互作用。数十年来，人们已经认识到高阶或间接相互作用的生态潜力，即不能还原为成对加成组分，而是由三个或更多物种的活动引起的相互作用，它们是群落结构的重要决定因素。识别组成物种之间的高阶相互作用对于准确预测对生态入侵（例如物种入侵或灭绝）的反应以及多物种群落的功能非常重要，因为通过直接相互作用的研究无法在子系统中充分预测此类特征。然而，推断和量化自然生态系统中的间接相互作用具有挑战性，需要进行细微且依赖模型的统计检验。构造或操纵的系统可达到更直接的测定结果，其中特定物种在其他物种的背景下被引入或去除。一些涉及宏观生物以及微生物的此类系统发现了显著的间接相互作用；但是一些设计微生物群落的研究发现弱相互作用或微不足道的高阶相互作用，其中包括一项线虫肠道菌种组合的研究。脊椎动物肠道中相互作用的复杂性仍然不清楚，但基于相关性方法从序列数据推断相互作用来假设成对相互作用已经足够了。我们使用无菌斑马鱼幼体（一种典型的脊椎动物）作为研究模型，结果表示当肠道中仅存在两种细菌时，会产生强的成对相互作用；而当存在四至五种时，则显示出弱的成对相互作用，这表明了高阶相互作用的重要性（图3）。在许多情况下，原始数据可以反映明显的影响。例如，当肠杆菌属菌株ZOR0001和气单胞菌ZOR0014共接种时，肠杆菌属菌株ZOR0001会受到气单胞菌ZOR0014的强烈抑制（图2B）。比较肠杆菌。除气单胞菌菌株以外的所有物种定殖的鱼类中的ZOR0014菌株丰度。相比之下，除气单胞菌菌株以外所有物种共接种的情况下，肠杆菌属菌株ZOR0001丰度与其他定殖在的鱼类肠道中的细菌丰度相比，差异很小，表明其他细菌群的存在会大大减弱肠杆菌属菌株ZOR0001-气单胞菌菌株之间的相互作用（图3A）。另外两个观察结果也暗示我们的肠道生态系统中存在强大的高阶相互作用。考虑到鱼类被所有五个细菌物种定殖，每个物种的平均丰度至少与仅根据直接相互作用所预测的丰度一样高（图4D）。此外，细菌种类的多样性比预期的要高，因为所有种类都出现在在超过50％的鱼肠道中，这与预测值相反（图4E）。考虑到所有五个细菌物种都定殖在鱼类肠道中，每个物种的丰度至少与之相同，细菌物种的多样性高于仅直接相互作用所预测的值。我们发现比某些肠道细菌物种系统中的成对相互作用更高的物种多样性与最近的理论研究一致，该理论表明，出于多种原因，更高层次的相互作用可能会稳定群落并促进共存。多物种共存这一主题在生态学上有着悠久的历史，包括成对相互作用的细菌的系统通常会随着物种数量的增加而变得不稳定，因此，解释如何存在复杂的群落一直是一个理论挑战。这个悖论有很多解决方案，例如空间异质性，营养级之间的相互作用以及时间变化。但是，即使没有这种额外的结构，将高阶项合并到一般的随机竞争互动模型中也会产生广泛的共存现象。这种大规模的共存也可以自然地从当代的资源竞争模型中出现在这种模型中，交叉喂养或新陈代谢的权衡必然涉及多个相互作用的物种。有趣的是，当我们一起接种所有五种肠道细菌时，它们的丰度分布彼此相似。而五种细菌群落的平均香农熵也类似于纯中性组装的群落。研究表明，对脊椎动物肠道中微生物组分之间的两种物种相互作用的测量不足以预测群落动态和组成。此外，他们暗示通过将Lotka-Volterra模型与成对相互作用项拟合来从物种间相互作用的微生物组数据推论。例如，通过用成对相互作用项拟合Lotka-Volterra型模型，不应将其视为代表基本的成对相互作用，例如，如果构成物种被隔离，则是在复杂环境中的有效相互作用后，易会表现出来。
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