科研 | Environment International：宏基因组和宏转录组联合揭示人、鸡和猪肠道微生物组中差异表达的抗性组
编译：红皇后，编辑：小菌菌、江舜尧。
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目前，全球每年由于抗生素抗性细菌感染导致的死亡人数超过了70万人，其中大部分来自于中低收入国家。由于新型抗生素的开发十分缓慢，因此，在不久的将来，我们可能会面临无药可用的情况。动物肠道微生物被认为是抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs) 的储存库，但是目前对于动物肠道菌群中ARGs的存在 (宏基因组DNA水平) 和表达 (宏转录组RNA水平) 的了解还十分有限。在研究中，作者同时利用宏基因组和宏转录组技术，对我国人类、鸡和猪肠道微生物组中ARGs的丰度、多样性和表达水平进行了综合的分析，在18个人类、鸡和猪的粪便样本中，共鉴定到了能够抵抗21类抗生素的330种ARGs。宏转录组分析表明，在人、鸡和猪肠道菌群中鉴定到的ARGs，分别只有49.4%、66.5%和56.6%有表达的，表明大部分ARGs是没有转录活性的。进一步的分析表明，具有转录活性的ARGs主要为四环素、氨基糖苷类和beta内酰胺类抗性基因。此外，研究还发现在人类和动物肠道中，多种杀虫剂、化学物质和重金属的抗性基因同样具有转录活性。本研究中宏基因组和宏转录组技术的联合分析是的我们能够特异性的将ARGs预期转录本相联系，为动物肠道菌群中ARGs的流行和表达提供了一个全面的展示。综上所诉，本研究的结果加深了我们对于人类、鸡和猪肠道菌群中ARGs和重金属抗性基因分布、进化和传播的理解。
论文ID
原名：Integratedmetagenomic and metatranscriptomic profiling reveals differentially expressed resistomes in human chicken, and pig gut microbiomes
译名：宏基因组和宏转录组联合揭示人、鸡和猪肠道微生物组中差异表达的抗性组
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2020
通信作者：高福
通信作者单位：中科院微生物研究所
实验设计
本研究的样本为人类、鸡和猪的新鲜粪便样本，分别采集自6个健康的人类、6只肉鸡和5头商品肉猪。鸡和猪分别来自汤阴和林州的养殖场，6个用于样本采集的人类志愿者年龄均大于20岁，男女各3人，并且在采集样本之前6个月没有服用过抗生素。所有样本均使用Invitrogen公司生产的RNAlater进行核酸的固定，之后立即冷链运输至实验室进行核酸的提取。
每一个样本被等分为两份，一份用于DNA提取，另一份用于RNA提取，DNA提取使用PowerFecalDNA Isolation Kit (QIAGEN)，RNA使用PowerMicrobiome RNA Isolation Kit (QIAGEN)进行提取，提取到的DNA和RNA分别是50 μL的TE buffer和RNase-free水洗脱，并使用NanoDrop测定其纯度和浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测提取核酸的完整性。使用RibominusTMTranscriptome Isolation Kit-Bacteria (Invitrogen)从提取的RNA中富集mRNA，之后分别使用KAPA Stranded mRNA-Seq Library PreparationKit和NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit构建mRNA和DNA的测序文库，使用IlluminaNovaSeq平台采用PE150测序进行宏转录组和宏基因组测序。
对于原始的测序数据，首先去除质量得分较低的、含有10个以上N碱基的以及与接头重叠部分超过15bp的序列，之后使用SOAP2将过滤后的序列分别与样本对应的宿主基因组进行比对以去除宿主序列的污染，对于宏转录组数据，还需要使用SortMeRNA去除其中的核糖体RNA序列。得到高质量的测序数据之后，使用SOAPdenoveo2对序列进行拼接，保留长度大于500bp的contigs用于后续的分析。使用MetaGeneMark识别contigs中的开放阅读框，之后利用CD-HIT对识别到的基因进行去冗余，去除所有覆盖率达于90%、一致性大于95%的基因，得到非冗余的基因集，最后使用SOAP2将高质量的测序数据与非冗余基因集比对，计算基因的相对丰度，整个过程均在MOCAT软件包中完成。
将非冗余基因集分别与CARD、ResFinder和BacMet比对，注释抗生素、杀虫剂和重金属抗性基因，注释的阈值分别为80%、95%和80%的一致性。对于注释到的ARGs，使用Kraken对其进行分类学注释，从而分析ARGs的潜在宿主，由于很多ARGs都具有可移动能力，因此ARGs的宿主只注释到门水平。通过将高质量的序列与一个自构建的可移动基因单元 (mobile genetic elements, MGEs) 数据库比对，注释测序数据中的MGEs，根据前人研究中的方法计算ARGs和MGEs的alpha多样性并进行主坐标分析 (PCoA)。
结果
1 构建人类、鸡和猪肠道微生物组非冗余基因集
本研究使用高通量测序技术分析人类、鸡和猪肠道微生物组中的ARGs及其转录本信息，本研究共获得了大约160Gb的宏基因组数据和大约360Gb的宏转录组数据，经过对宏基因组和宏转录组数据的拼接和开放阅读框识别，最后分别建立了人类、鸡和猪样本的非冗余基因集，结果表明猪的肠道菌群中基因的数目要高于人类和鸡，分别为1,248,314、809,635和312,579个基因。
2 宏基因组中ARGs的检出、丰度和多样性
通过将非冗余基因集使用BLASTP与CARD数据库比对，鉴定人类、鸡和猪肠道宏基因组数据中的ARGs，在所有的样本中，共鉴定到了166类、330种ARGs，能够抵抗21种不同的抗生素，这些ARGs主要属于3种抗性机：抗生素失火、抗生素靶标保护以及抗生素靶标修饰。在这些ARGs抵抗的21种抗生素种，抵抗其中20种抗生素的ARGs在18个样本中均有检出，只有抵抗莫匹罗星的ARGs在猪的样本中没有检出。四环素、大环内酯、氨基糖苷类、林可胺类以及beta内酰胺类抗性基因在18个样本中的检出比例和丰度要高于其它类型的ARGs。ARGs的相对丰度在不同类型样本中变化很大，但是四环素抗性基因为人类、鸡和猪样本中丰度最高的ARGs，相对丰度可以达到48%、32%和48%。基于宏基因组数据的PCoA表明，人类、鸡和猪肠道微生物中的抗生素抗性组具有明显的差异。
图1 (A) 不同样本中抵抗不同抗生素的ARGs的相对丰度(宏基因组)；(C) 不同样本中ARGs的抗性机制类型分布 (宏基因组)；(E) 不同样本中抗生素抗性组的PCoA结果(宏基因组)。
进一步分析不同类型样本中ARGs的详细组成情况，在鉴定到的166类ARGs中，人类、鸡和猪样本中分别检出了147、156和151种，ARGs的多样性在鸡的肠道菌群中最低，但是其具有最高的ARGs丰度 (图2E)。四环素抗性基因主要在人类和猪的样本中检出，在所有四环素抗性基因组中，只有4种在所有样本中均存在 (tetQ、tetW、tetM和tetO)。除此之外，tetX在6个人类、6个猪和3个鸡的样本中存在。所有31个氨基糖胺类抗性基因中，只有APH(3′)-IIIa和 AAC(6′)-Ie-APH(2′')-Ia在所有样本中均有检出。
图2 (E) 不同样本宏基因组数据中ARGs相对丰度的比较。
丰度排名前10的ARGs在猪、人和鸡样本中所占的比例分别为67.6%、76.1%和79.3%，在不同样本中，主要的ARGs个不太相同，在人类中，排名前10的ARGs为tetQ、tet37、tet32、tetO、tetW、tet40、ErmF、ErmB、CfxA3和CfxA6；在猪中，为tetQ、tetW、tet40、tetO、tetL、APH(3′)-IIIa、ErmF、ErmB、lnuC和mefA；在鸡中，为tetW、tetL、ErmT、ErmB、ErmC、poxtA、cat、AAC(6′)-Ie-APH(2′')-Ia、APH(3′)-IIIa和lnuA。值得注意的是，poxtA基因在鸡肠道菌群中的丰度要高于人类和猪。
3 ARGs转录本的检出、丰度和多样性
在宏基因组中鉴定的大部分ARGS在宏转录组数据中都是存在的，说明其具有转录活性 (图1B)。PCoA表明不同类型样本中ARGs的转录图谱差异很大，说明人类、鸡和猪肠道微生物组中抗生素抗性组的差异并不仅仅表现在组成上，同样表现在其转录水平中。大环内酯类、氨基糖苷类和四环素类抗性基因在所有样本的宏转录组数据中均具有较高的丰度。大部分有转录活性的ARGs在宏基因组数据中同样是占主要地位的ARGs，但是其表达水平与基因丰度之间具有明显变化。Beta内酰胺抗性基因的表达水平在人类和猪肠道微生物组中要高于鸡。虽然在人类、鸡和猪的肠道微生物组中检出了很多四环素抗性基因，但是其中只有很少一部分具有表达活性。ARGs转录本对应的主要抗性机制为抗生素失活，其次为抗生素靶标修饰 (图1D)。
图1 (B) 不同样本中抵抗不同抗生素的ARGs的相对丰度(宏转录组)；(D) 不同样本中ARGs的抗性机制类型分布 (宏转录组)；(F) 不同样本中抗生素抗性组的PCoA结果(宏转录组)。
人类、鸡和猪样本中ARGs的检出数目要显著高于其表达的ARGs转录本数目 (图2A-C)。人类肠道微生物中，平均ARGs的转录比例为49.4%，要低于鸡(66.5%)和猪 (56.6%) (图2D)。同时，在研究的3组样本中，人类样本具有最低的转录ARGs多样性和最低的ARGs转录本丰度 (图2F)，这些结果表明，人类肠道微生物中ARGs的活性可能要低于作为人类食物的动物。ErmB、APH(3′)-IIIa、tetW、lnuC、ErmT、tetQ、AAC(6′)-Ie-APH(2′')-Ia、poxtA、tetM和tetO是所有样本中表达水平排名前10位的ARGs，其中部分高表达的ARGs在宏基因组数据中并不占主要地位，说明在动物肠道微生物组中，部分ARGs的丰度与其表达水平并不一致。
图2 人类、鸡和猪肠道微生物组中ARGs及其转录本丰度和多样性的比较。(A-C) 人类、鸡和猪肠道微生物组中ARGs数目和ARGs转录本数目的比较。(D)不同样本中ARGs的转录比例。(E)不同样本中ARGs的检出丰度比较。(F)不同样本中ARGs的转录总水平比较。
4 人类、鸡和猪中共有的ARGs和ARG转录本
大部分检出的ARGs和ARG转录本在3类不同样本中共有，人、鸡和猪肠道微生物组中共有的ARGs有200种，分属19个不同的抗生素抗性分类，占所有检出ARGs的61%以上 (图3A和3C)。在这些共有的ARGs中，四环素、大环内酯类和氨基糖胺类抗性基因占主要地位，共有ARGs中的beta内酰胺抗性基因在人类和猪肠道微生物组中的丰度要高于鸡。
图3 (A) 人、鸡和猪肠道微生物中共有和特有ARGs的数目。(C) 共有ARGs的相对丰度。
在检出的ARG转录本中，有128种在人、鸡和猪三类样本中共有，占所有检出ARG转录本数目的44% ，其中大部分属于四环素、大环内酯类、氨基糖苷类、林可胺类和beta内酰胺类抗性基因(图3B和3D)。值得注意的是，在表达水平排名前10的ARGs中，只有APH(3′)-IIIa在3类样本中共有。
图3 (B) 人、鸡和猪肠道微生物中共有和特有ARGs转录本的数目。(D) 共有ARGs转录本的相对丰度。
5 细菌中获得的ARGs和MGEs
在人类、鸡和猪肠道菌群中，分别有84、93和86种ARGs通过RefFinder注释被鉴定为由其它微生物处获得的ARGs，其中主要是氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、beta内酰胺类抗性基因 (图4A)。人类肠道微生物组中被鉴定到的外源获得ARGs的数目、ARGs转录本的数目以及其相对丰度均低于鸡和猪 (图4B-E)。这些外源获得ARGs的主要类型在不同样本中各不相同 (图4F和4G)，这些外源获得ARGs的宿主微生物主要为厚壁菌门和变形菌门，宏基因组和宏转录组的数据均显示该结果 (图4H)。
图4 (A) 不同样本中外源获得ARGs和ARG转录本的丰富度。(B)不同样本中外源获得ARGs数目的比较。(C)不同样本中外源获得ARG转录本数目的比较。(D)不同样本中外源获得ARGs相对丰度的比较。(E)不同样本中外源获得ARG转录本相对丰度的比较。(F)不同样本中不同类型外源获得ARGs相对丰度的热图比较。(G)不同样本中不同类型外源获得ARG转录本相对丰度的热图比较。(H) 不同宿主微生物中识别外源获得ARGs和ARG转录本的数目。
6 抗细菌类杀虫剂和重金属抗性基因
在所测定的样本中，共发现了184种杀虫剂和重金属抗性基因，人类样本中含有这些基因的数据最高，但是鸡粪便样本中，这些基因的表达水平最高 (图5)。人类中丰度最高的重金属抗性基因为Cu和Zn抗性基因，杀虫剂抗性基因中大部分基因用于抵抗过氧化氢、苯扎氯铵和脱氧胆酸钠，化学物质抗性基因中，大部分都是用于抵抗季胺类物质。
图5 (A)不同样本中重金属抗性基因的数目。(B)不同样本中重金属抗性基因转录本的数目。(C) 不同样本中杀虫剂抗性基因的数目。(D)不同样本中杀虫剂抗性基因转录本的数目。(E) 不同样本中化学物质抗性基因的数目。(F)不同样本中化学物质抗性基因转录本的数目。
讨论
本研究发现了人类、鸡和猪肠道菌群中含有多种ARGs，并且其中相当一部分具有转录活性，通过RNA水平分析的结果与DNA水平的结果具有很大的差异，表明动物肠道中ARGs的表达与其存在丰度之间并不是直接的对应关系。同时使用宏基因组和宏转录组的方法研究微生物群落的抗生素抗性组已经在多个自然环境中被实现。但是有关人类和作为食物的动物肠道微生物组中ARGs的表达信息还依然很少，本研究的结果表明鸡的肠道菌群中ARGs的表达水平可能更高，并且其通过MEGs进行水平基因转移的频率也可能高于人类和猪。
本研究发现许多ARGs是人类、鸡和猪肠道微生物组中共有的，表明这些ARGs十分适应肠道环境，并且可能受到了相同的选择性压力。目前已经发现了多种能够选择ARGs的非抗生素物质，比如重金属和消毒剂，本研究同时在动物肠道中检出了多种重金属、杀虫剂恶化化学物质类抗性基因，这意味了更多的研究需要关注在这些基因与ARGs的共选择上。
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