科研│香港中文大学：正常和闭锁卵泡中猪卵巢颗粒细胞的转录组学分析：类固醇生成和氧化应激的作用（国人佳作）
编译：微科盟 伊安，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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女性不孕的主要原因之一是窦状卵泡闭锁，其潜在的分子机制尚不清楚。因此，研究人员通过ELISA、RNA-Seq、qRT- PCR和免疫组化，研究正常窦状卵泡（HA）和晚期闭锁窦状卵泡（AA）的转录组学变化。颗粒细胞RNA-Seq结果显示，AA中有2160个差异表达基因，其中1483个高表达，677个低表达。生物信息学分析表明，AA卵泡中上调的基因在炎症和凋亡过程中高度富集，而下调的转录本主要集中在类固醇生物合成途径和氧化应激过程中，包括参与谷胱甘肽代谢途径的抗氧化基因(如GSTA1、GCLC、GCLM、IDH1、GPX8)和其他氧化还原相关基因(如RM2B、NDUFS4)。此外，AA颗粒细胞表达更强的8-OHdG免疫染色，这是氧化DNA损伤的标志，提示氧化应激可能参与卵泡闭锁。因此，研究人员假设抗凋亡因子和类固醇激素的减少与氧化应激标志物和促凋亡因子的表达增加都是窦状卵泡闭锁的原因。
论文ID
原名：Transcriptome Analysis of Porcine Granulosa Cells in Healthy and Atretic Follicles: Role of Steroidogenesis and Oxidative Stress
译名：正常和闭锁卵泡中猪卵巢颗粒细胞的转录组学分析：类固醇生成和氧化应激的作用
期刊：Antioxidants
IF：5.014
发表时间：2020年12月
通讯作者：Chi Chiu Wang
通讯作者单位：香港中文大学
DOI号：10.3390/antiox10010022
实验设计
结果
1 卵泡闭锁过程中差异表达基因
AA卵泡液（FF）的睾酮浓度明显低于HA FF，而HA FF与AA FF之间的孕酮含量无明显差异(图1A，B)。
为了研究HA和AA滤泡的转录变化，研究人员对颗粒细胞进行RNA测序分析。HA和AA滤泡中共检测到15205个mRNA转录本，其中差异表达基因(DEGs) 2160个(绝对倍数变化(FC)≥1.5,p≤0.05)。其中，1971个转录本为注释转录本，189个为未知转录本。2160个DEGs包括677个下调转录本和1483个显著上调转录本(图2A)。所有上调和下调的mRNA转录本进一步通过聚类分析进行评估(图2B)。该分析显示HA和AA组间具有良好的相关性，并具有明显差异。
图1.健康的窦状卵泡(HA)和窦状闭锁卵泡(AA)卵泡液中的激素浓度(4-7mm)。(A)睾酮浓度(ng/mL)。(B)孕酮浓度(ng/mL)。
图2.DEGs表达谱。(A)火山图, 横轴表示被检测转录本FC，纵轴表示p值；(B)聚类分析，行表示差异倍数，列表示不同的样本，采用Pearson相关分析对差异基因进行分类。
2 差异倍数最大转录本
AA颗粒细胞中高表达的前50个转录本中，编码趋化因子C-X-C基序配体13(一种炎症因子)的CXCL13排在最前面，后面是两个未知转录本ENSSSCG00000001783和ENSSSCG00000026265。其他几个与炎症过程直接相关的基因包括CHI3L1(编码糖基水解酶18家族的糖蛋白成员)、Toll样受体家族成员TLR4和TLR9以及编码β趋化因子受体家族成员的CCR1(C-C基序趋化因子受体1)都在闭锁卵泡中高表达。此外，与HA相比，AA颗粒细胞中分泌配体转化生长因子β2(TGF-β2)及其受体2(TGFBR2)的促凋亡基因TGF-β2的表达也明显增强。
相反，类固醇激素生物合成相关基因，包括类固醇生成急性调节蛋白(STAR)和黄体生成素绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)，均在HA颗粒细胞中高表达。
3 RNA-Seq生物信息学分析
研究人员通过David进行GO和KEGG富集分析，比较AA和HA中下调和上调基因的表达情况。GO分析显示下调的DEGs富集生物过程有“氧化应激的反应”、“氧化还原过程”和“有丝分裂核分裂的调控”(图3A)。KEGG分析显示下调的DEGs在“代谢通路”和氧化应激相关通路“谷胱甘肽代谢”上显著富集（图3B）。此外，“类固醇生物合成”和“卵巢类固醇生成”途径也显著富集（图3B）。GO分析显示上调的DEGs富集生物过程有“炎症反应”、“免疫反应”、“吞噬、吞噬”、“整合素介导的信号途径”和“Toll样受体4信号途径”(图3C)。KEGG分析显示上调的DEGs在“吞噬小体”、“趋化因子信号通路”和“Toll样受体信号通路”等相关炎症通路显著富集(图3D)。除了与炎症相关的通路外，与凋亡相关的通路，包括“HIF-1信号通路”、“TGF-β信号通路”、“TNF信号通路”和“凋亡”通路也显著富集(图3D)。
研究人员通过将实验中所有表达基因的预排序列表与GSEA数据库的基因集进行比较，使得David分析结果得到了GSEA的进一步支持。GO和KEGG基因组还显示，AA卵泡颗粒细胞中参与氧化应激和类固醇激素生物合成的下调基因显著富集，参与炎症和凋亡过程的上调基因显著富集。GSEA效应显示达下调基因显著富集的通路包括氧化磷酸化，细胞周期相关的“G2检查点”和“体内胆固醇平衡”(图3E) 而上调的基因则显著富集在诸如炎症反应和细胞凋亡，包括“凋亡”、“缺氧”、“P53通路”和“TGFB信号”(图3F)。
基于以上广泛的分子途径分析结果，我们选择了卵巢类固醇生成和氧化应激反应这两个调控最密切的过程进行进一步的功能分析，因为这两个过程在卵泡发育和闭锁中起着直接作用。
图3. GO和KEGG分析。(A) 下调DEGs富集生物过程；(B) 上调DEGs富集生物过程；(C) 下调DEGs富集KEGG通路；(D) 上调DEGs富集KEGG通路，每个气泡的大小和颜色分别表示每个通路中基因的数量和P值；(E) GSEA分析富集下调通路；(F) GSEA分析富集上调通路。
4 参与卵巢类固醇合成的下调基因
单个转录本分析显示AA中参与类固醇生成的基因表达下调，例如StAR, LHCGR, CYP19A1, AKR1C1, AKR1C4, NR5A2, CYP51A1和 HSD17B1 (图4A)。此外，AA颗粒细胞的IGF1表达较低。而AA颗粒细胞中FSHR基因的mRNA含量明显高于HA。研究人员选择StAR、LHCGR、CYP19A1、AKR1C1、NR5A2、HSD17B11和IGF1进行qRT-PCR检测(图4B);结果表明这些基因都被显著调控，证实了RNA-seq分析结果。CYP19A1、2和3分别在猪卵巢、胎盘和胚胎组织中表达，同源性大于99%。由于CYP19A1下调，研究人员进一步分析了芳香化酶(CYP19A1-3)蛋白的表达。与mRNA水平一致，AA颗粒细胞芳香化酶蛋白表达低于HA (图4C-E)。
图4.参与类固醇合成的基因显著下调。A：热图；B：qRT-PCR验证下调参与类固醇合成基因；正常(C)和闭锁卵泡(D)代表性芳香化酶免疫染色；E:闭锁卵泡颗粒细胞芳香化酶荧光强度定量结果显示，与正常卵泡相比，颗粒细胞的芳香化酶荧光强度明显降低。芳香化酶荧光定量结果显示，AA颗粒细胞的芳香化酶荧光强度明显低于HA。数据以mean ± SD表示，**：p<0.0001；**：p<0.01，*：p<0.0001。
5 氧化应激和窦状卵泡闭锁
单个转录本分析显示抗氧化相关基因在AA颗粒细胞中的表达也下调，如GCLC, DHCR24, IDH1, TXNIP, GCLM, MSRB2, GPX8, GSTA1和RRM2B(Figure 5A)。研究人员选择与谷胱甘肽代谢途径有关的GCLC，IDH1，GCLM，GPX8，GSTA1和RRM2B进行qRT-PCR检测(图5B)，与RNA-seq数据一致，所有这些基因都显著下调。研究人员还分析了谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基GCLC表达水平，并根据mRNA浓度观察到AA颗粒细胞GCLC表达低于HA (图5C-E)。
为了研究AA颗粒细胞抗氧化基因和蛋白表达的降低是否与氧化应激的增加有关，研究人员对氧化应激过程中DNA氧化标记物8-OhdG进行了研究。结果显示AA颗粒细胞中8-OHdG免疫组化阳性百分率比HA高5倍以上(图5F-H)，表明AA颗粒细胞中存在氧化应激。与这些观察结果相一致，AA颗粒细胞中ki67阳性的百分比明显下降，表明AA颗粒细胞的增殖减少(图5I-K)。
图5.氧化应激与窦性卵泡闭锁相关。A：热图；B：qRT-PCR验证下调抗氧化基因；(C - K)免疫染色，GCLC、8-OHdG和Ki67(棕色染色)作为HA(C, F, I)和AA(D, G, J)中氧化应激和细胞增殖的标记物(n = 6)。GCLC的代表性免疫荧光染色(C, D)，8-OHdG (F, G)和Ki67 (I, J)的DAB染色。免疫荧光分析显示AA颗粒细胞中GCLC的荧光强度明显低于HA (E组)，8-OHdG免疫染色阳性细胞百分率明显高于HA。相反，与HA (J)相比，AA Ki67免疫阳性颗粒细胞的百分率明显降低。*：p<0.05；**：p<0.01；*：p<0.001。
讨论
本研究利用RNA-Seq分析技术对HA和AA颗粒细胞进行转录组表达分析，以鉴定颗粒细胞的DEGs。生物信息学分析表明，下调的转录本主要富集在甾体生物合成和氧化应激反应过程中，包括参与谷胱甘肽代谢途径的抗氧化基因和其他氧化还原相关基因。这些观察结果经RT-qPCR和免疫组化得到证实。以往的研究已经用基因芯片技术研究了猪闭锁早期小卵泡(直径1~2 mm)和中型卵泡(直径3~5 mm)中颗粒细胞的基因表达谱。本研究是第一次对猪HA颗粒细胞和晚期AA中大型卵泡(直径4-7 mm)的分子差异进行RNA-Seq分析。
雌二醇对卵泡生长发育至关重要。猪AA颗粒细胞CYP19A1的表达从卵泡期开始直到排卵前约5天后升高。当有腔卵泡被选择进入卵泡生长池时，卵泡液β -雌二醇浓度随卵泡直径的增加而增加。与HA相比，AA中的雌二醇水平降低。转录组分析显示AA中胆固醇和类固醇生物合成途径相关基因表达减少。用芳香化酶抗体(CYP19A1-3)进行免疫染色，从蛋白水平证实AA颗粒细胞芳香化酶表达降低，这可能是AA中FF雌二醇水平降低的原因。
除了参与类固醇代谢的酶编码基因外，HA和AA颗粒细胞中参与调节卵巢类固醇生成酶的基因表达也存在差异。这些差异表达基因有FSHR、LHCGR和IGF1。在啮齿类动物中，最初的假设是，增加FSHR表达可能通过增强FSH反应，刺激雌二醇的产生。根据这一假说，FSHR在小到中等大小(3 - 5mm)的AA早期卵泡中表达较低。人惊讶的是，与HA卵泡相比，FSHR基因在中晚期大卵泡猪颗粒细胞中的表达增加。对这种差异的解释可能与卵泡状态(晚期与早期闭锁)和卵泡大小的差异(小到中与中到大)有关。中到大卵泡最初试图避免闭锁可能会通过增加FSHR的表达启动抗凋亡信号传导。在卵泡发育的后期，FSH信号通路的激活显然不足以维持卵泡的健康发育，从而促进卵泡闭锁。Liu et al等研究表明在健康的中、大型有腔卵泡中，FSHR在颗粒细胞中的表达低于较小卵泡的颗粒细胞。这意味着LH信号对于颗粒细胞的存活可能是必需的。其他研究表明，LH可以激活芳香化酶，从而通过激活人黄体颗粒细胞中的LHCGR来促进雌二醇的产生。因此，猪颗粒细胞中LHCGR mRNA表达的缺失与中到大卵泡的晚期AA有关。HA颗粒细胞中IGF1基因的表达水平高于AA晚期。IGF1增强了LH对猪颗粒细胞类固醇生成包括雌二醇合成的影响。FSH、LH、IGF1和雌二醇被认为是抗凋亡因子；缺乏这些因素可能导致颗粒细胞凋亡，这一过程可能与氧化应激有关。
转录组分析进一步显示AA颗粒细胞中谷胱甘肽代谢途径相关基因的表达减少。例如，其中5个转录本(GCLC、GCLM、IDH1、GSTA1和GPX8)在晚期AA中显著下调。GCLC和GCLM是谷氨酸-半胱氨酸连接酶的两个亚基，是谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶，谷胱甘肽是H2O2的重要抗氧化剂。免疫荧光染色证实了AA中GCLC mRNA含量降低，支持了ROS水平可能在这些颗粒细胞中升高的假设。AA中IDH1 mRNA含量的降低进一步支持了这一假设。IDH1胞质中重要的代谢酶，产生NADPH，同时对对GSSH再生谷胱甘肽(GSH)至关重要。通过单细胞测序，分析细胞特异性的衰老相关转录变化，发现老年非人灵长类卵巢中的颗粒细胞容易受到更高的氧化应激，IDH1的表达低于年轻对照组。利用人KGN颗粒细胞系进行的进一步功能研究表明，沉默IDH1会导致ROS水平升高，从而诱导颗粒细胞凋亡。除了与谷胱甘肽生成相关的基因外，凋亡颗粒细胞中ROS水平升高的假设支持来自于使用谷胱甘肽来解毒ROS水平升高的DEGs的表达降低。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)家族(GPX 1-8)的新成员GPx8使用GSH来还原H2O2和其他ROOH。尽管在卵巢中的研究较少，但有报道称GPx8过表达可显著提高INS-1E β -细胞脂毒性诱导的内质网(ER)抗氧化能力。这些结果提示谷胱甘肽代谢途径活性降低在窦性卵泡闭锁中可能起作用。
AA卵泡颗粒细胞抗氧化能力降低的假设，进一步得到了其他氧化还原相关基因RRM2B、NDUFS4、DHCR24和MSRB2下调的支持。RRM2B是一种应激反应蛋白，已被报道通过降低ROS水平来保护人类成纤维细胞免受氧化应激。NDUFS4编码第一线粒体氧化磷酸化复合物的辅助亚基;在NDUFS4−/−小鼠的原代肌细胞和皮肤成纤维细胞中观察到ROS水平升高和线粒体形态异常。体外实验表明，DHCR24(编码3 β -羟甾体-∆24还原酶)抑制MIN6细胞内ROS的产生，保护这些细胞免受凋亡。最后，MSRB2(编码蛋氨酸亚砜还原酶B2)催化游离的和基于蛋白质的蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸。在一些组织中，MSRB2保护细胞免受线粒体相关氧化应激的损伤。这些基因在AA卵泡颗粒细胞中表达降低，提示氧化损伤在卵泡闭锁中的作用，8-OHdG的免疫组织化学染色支持这一假设。8-OHdG核免疫染色在AA卵泡的颗粒细胞中呈中到强染色，而在HA卵泡的颗粒细胞中几乎不表达。
与此相对应的是，在对晚期AA上调基因进行通路分析时，凋亡相关通路主要为“HIF-1信号通路”、“TGFβ信号通路”、“TNF信号通路”、“p53信号通路”和“凋亡”。TGFβ、TNF-α和p53信号已被证明参与了卵巢卵泡闭锁。以TGF-β为例，参与TGF-β信号通路的差异表达基因有TGFβ 1、TGF β 2、SMAD2、SMAD7。体外研究表明，在不加促性腺激素的情况下，加入TGFβ1促进了牛颗粒细胞的凋亡，同时抑制了细胞的增殖，这与我们观察到的AA颗粒细胞Ki67免疫染色的减少是一致的。同样，在人KGN颗粒细胞系中，补充TGFβ2会增加细胞凋亡的发生率。TGF β通过影响Smad7的表达促进颗粒细胞凋亡，过表达Smad7显著增加小鼠颗粒细胞凋亡，而Smad7表达降低则显著阻碍TGF β诱导的细胞凋亡。此外，Smad2在人HK2细胞中的表达下调可减轻p53介导的细胞凋亡。
结论
综上所述，本研究通过RNA-Seq分析，提供了HA和AA之间全面的转录组差异。这项研究表明，降低类固醇激素合成相关基因的表达和抗凋亡因子的同时,减少参与氧化还原基因的表达导致氧化应激标志物的增加,都可能导致窦状卵泡闭锁。
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