科研 | mBio：将土壤微生物分解成简化的功能模块
编译：国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。
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土壤微生物组代表了地球上最复杂的微生物群落之一，涵盖了成千上万的生物分类和代谢途径，使整体分析在计算上变得十分繁琐且困难。在这里，本文开发了一种替代方法，其中根据代谢能力将复杂的土壤微生物组分解为各个组成部分（“功能模块”），以进行个性化表征。本文假设可以通过有针对性的富集获得代表功能模块的可再现的，低复杂性的群落，并且这些群落组合起来将包含很大程度的土壤微生物组多样性。在起始土壤接种物上进行富集，该土壤接种物基于特定的碳底物，抗生素，厌氧条件下的替代电子受体或反映共同田间胁迫的替代生长条件下的特定培养基。通过16S rRNA扩增子测序评估所得的群落。较宽松的模块（无氧条件，复杂的多糖和某些应力）导致群落特征更加鲜明，具有更高的丰富度和重复之间的变异性，而具有简单底物的模块则以较少的物种为主，并且具有更高的重现性。总体上，在整个功能模块中发现了大约27％的液态土壤提取物对照中存在的独特分类群。原始模块中未充分显示或未检测到的分类单元也富集了整个模块。在模块的一个子集上进行了转录组分析，以研究功能基因表达的差异。这些结果表明，与使用更全面的分析相比，通过将土壤微生物组分解为离散的成分，可以更全面地了解土壤微生物组及其生化潜力。
论文ID
原名：Deconstructing the Soil Microbiome into Reduced-Complexity Functional Modules
译名：将土壤微生物分解成简化复杂的功能模块
期刊：mBio
IF：6.784
发表时间：20207
通讯作者：Ryan McClurea
作者单位：美国西北太平洋国家实验室
实验设计
为每个功能模块创建了不同的媒体类型。所有功能模块介质均基于1种最小的M9介质，其后的修饰因具体模块而异。对于所有基于简单底物利用率的模块，M9培养基均添加了10 mM碳底物。这些底物包括乙酸钠，阿拉伯糖，柠檬酸钠，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸，半乳糖，葡萄糖胺，葡萄糖，谷氨酸盐，甘油，甘氨酸，苹果酸钠，甘露糖，N-乙酰基葡萄糖胺，丙酸钠，丙酮酸钠，鼠李糖，和木糖，在高压灭菌之前添加所有底物。
所有抗生素模块均基于补充有抗生素的M9+葡萄糖（M9葡萄糖）模块，在高压灭菌后添加，以避免变性，然后过滤灭菌新培养基。测试了多个浓度的水平，该水平将在施加选择性力的同时仍允许其生长，这是通过相对于未补充葡萄糖的对照在600 nm（OD600）处的光密度随时间的增加而测得的。最终确定浓度为15μg/ ml的苯菌灵，128μg/ ml的氯霉素，100μg/ ml的红霉素，50μg/ ml的制霉菌素和100μg/ ml的硫酸链霉素的浓度。多糖模块基于向最少的M9培养基中添加10 mM碳源。底物包括：羧甲基纤维素（代表纤维素），木聚糖（特别是纯化的山毛榉木聚糖），果胶，甲壳质（从蟹壳纯化），纤维二糖，海藻糖和蔗糖。除果胶外，在高压灭菌之前添加所有多糖/二糖底物。通过在70°C搅拌下溶解，将果胶添加到高压灭菌的基本M9培养基中，然后进行过滤器灭菌（孔径0.22 m）以除去可能的污染物。
厌氧模块基于M9葡萄糖的替代氧化还原受体的补充，并用特定的气体混合物冲洗30分钟以除去残留的O2。用M9葡萄糖构建基本的厌氧模块，称为“乙酸原”模块，并用纯N2气体冲洗。通过用0.5g /升七水合硫酸铁过滤除菌（“ fs”）或高压灭菌（“ nonfs”）M9葡萄糖来构建硫酸铁培养基，然后用9：1 的N2：H2冲洗。通过向M9葡萄糖中添加0.5克/升硝酸钾，高压灭菌，然后用4：1的 N2：CO2冲洗来构建硝酸钾培养基。通过向M9葡萄糖中添加13克柠檬酸铁（III），高压灭菌，然后用9：1 的N2：H2冲洗来构建柠檬酸铁培养基。设计了几个功能模块，以对土壤微生物组施加进一步的应力扰动。通过相对于pH或盐浓度改变葡萄糖和N-乙酰氨基葡糖模块来进行初步的压力测试。在这些测试中，起始的最低M9培养基的pH从7更改为6或8，从而在添加葡萄糖或N之前相应地改变了磷酸二氢钠与磷酸氢二钾的比率。在通过16S rRNA基因测序确定相对于未施加压力的葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖模块而言，施加的应力会影响所得的群落，然后设计了其他的胁迫模块。这些模块结合使用了三种碳底物之一和八个替代生长条件之一，这些条件旨在模拟土壤微生物可能承受的压力。其中包括：
（i）“ 10％C”，将碳底物稀释10倍；
（ii）“ 2,4-D”补充剂，其最终浓度为10 mM的除草剂2,4-二氯苯氧基乙酸）；
（iii）“加热”，恒定培养温度为40°C；
（iv）“晚收获”，即1周后收获；
（v）“光”，在恒定光源下的生长；
（vi）“ PEG”，以足以施加1.0 MPa的最终渗透压的量向介质中补充聚乙二醇；
（vii）“ pH 8”，将初始M9培养基从pH 7更改为pH 8；
（viii）“盐”，添加氯化钠至终浓度为0.8 M，以施加盐胁迫。
结果
1 设计功能模块
模块之间群落结构的相似性在很大程度上取决于模块类别；例如，简单的底物模块彼此相似，并且与某些多糖和应力模块相似（图1a）。同时，厌氧模块和其他应力模块与大多数其他模块不同（图1a）。当使用非加权方法时，除某些“压力”模块（图1b和c）外，在模块中未检测到在液态土壤提取物对照或原生土壤对照中检测到的大多数分类类别，在本地土壤或液态土壤提取物对照中检测到更多类别的蛋白质。
图1功能模块群落与存在/不存在热图之间的距离
2 功能模块的多样性和丰富性降低
图2 完整的alpha多样性和beta多样性趋势数据集。
3 功能模块群落概要
液态土壤提取物对照中的主要门类包括变形杆菌（平均相对丰度46.2％）和拟杆菌（44.2％），其次是疣状微生物菌（4.3％）和放线菌（1.3％）（图3a）。主要类别包括嗜噬菌素（18.3％），变形杆菌（18.2％），变形杆菌（16.4％）和变形杆菌（11.5％）（图3b）。
图3 完整数据集，门类级别和类级别的群落趋势。
图4 加权UniFrac距离和嵌套/转换趋势的应力数据集。
4 功能模块代表的土壤多样性
本文将功能模块与本地土壤控制群落进行了比较，以确定本文如何很好地捕获土壤分类学多样性。计算每个功能模块的核心微生物组，以获得对微生物的理解不断丰富，从而代表了给定的模块。对照液态土壤提取物微生物组包含横跨25个门的717个独特的OTU，其中1个功能模块的核心中存在192个（26.7％）（图5b）。包容性最强的模块类别是“压力”（179个土壤OTU）和“多糖类”（80个土壤OTU）（图5a），包容性最强的单个模块是盐胁迫下的木聚糖和木糖（图5d）。然而，在本文的模块中，液态土壤提取物对照中仍未发现门（Planctomycetes）或稀有（Verrucomicrobia）（图5c），并且可能需要其他策略来丰富它们。本文使用原生土壤（固体）重复了此分析，以与原始来源土壤进行比较。在原生土壤中有1378个独特的OTU，其中在液态土壤提取物对照中发现416个，在“胁迫”中发现185个，在“多糖”中发现59个，其他所有类别都低于30。本文在模块岩心中获得了341个独特的OTU，而在对照液态土壤提取物微生物组中却没有（图5b），当将模块岩心与天然土壤进行比较时，这个数字只有331个。
图5 土壤对照和功能模块之间的微生物组比较。
5 模块在功能上是不同的
为标准化的转录本丰度表和相应的16S rRNA基因扩增子数据构建了Bray-Curtis不相似对象。在两个数据集中，“模块名”均能解释Bray-Curtis不相似性的变化（表S5），并且在聚集在一起的模块内复制（图6a至图6c），表明了功能和分类概况的模块富集模式。此外，Mantel检验证实，16S rRNA基因扩增子与转录本样本之间的Bray-Curtis距离之间存在显着相关性，表明分类学上越相似的样本，它们在功能上就越相似。模块之间的功能重现性也有所不同。 N-乙酰氨基葡糖，木糖和庆大霉素的表达模式相对一致，而果胶和木聚糖的可变性更高（图6d）。
图6 RNA序列的功能趋势。
6 功能模块的网络分析
本研究整合了转录组数据，以鉴定占据土壤微生物组中央和潜在代谢重要位置的基因/分类群。相关性上下文相似性（CLR）算法用于基于互信息来推断连接基因的共表达网络。然后，将分类学和集中度信息整合在一起，以鉴定高度集中的基因和分类群。对于分类单元，与16S rRNA基因扩增子分析的结果相反（图3b），与其他分类单元的基因相比，γ变形杆菌和β变形细菌的基因的中心性要低得多（图7a和b）。 Betaproteobacteria的居中性中心值与其丰度水平大致相符。相比之下，其他类别的相对丰度较低（基于16S扩增子测序）（图3b），但表达的集中度很高，包括细胞外溶质结合蛋白（Rubrobacteria），过氧化氢酶过氧化物酶，NADH-醌氧化还原酶（Vicinamibacteria）和含ABC1域的蛋白质（Acidimicrobiia）。这些基因占据了高介导性的瓶颈位置，并在整个网络中起到了连接大量其他基因的作用。为了研究功能的中心性，将与五个模块中的每个模块显着相关的转录本放置在网络中（图7c）。与属于其他模块的基因和网络中所有基因的平均中心度相比，对与N-乙酰氨基葡萄糖和木糖孵育的基因具有更高的中心度（图7d）。与富含果胶和木聚糖的基因相比，富含N-乙酰氨基葡萄糖的基因在统计上具有更高的中间性。与木聚糖，果胶和木糖反应的基因之间的中间性中心值比平均中间性低得多（分别为7.9、8.0和1.99倍），尽管这些变化在统计上并不显着。
图7 转录组数据的网络分析。
结论
在这项工作中，本文根据功能将土壤微生物组解构为离散的模块。所得的模块群落降低了复杂性，再现性变化，并且代表了液态土壤提取物对照或天然土壤中存在的多样性的很大程度，同时也丰富了两种土壤中稀有或无法检测到的微生物。本文还证明了，尽管丰度很低，但通过表达一些高度重要的基因，它们在很大程度上促进了模块的功能。以前已经使用底物富集）或压力扰动进行了来自复杂母体微生物组不同菌剂的目标富集，以研究底物摄取和分解趋势，以确定生物分类多样性和/或在其上的生长碳源，或获得降低复杂性的菌剂，以优化元基因组中的全基因组装箱。在这里，本文通过使用功能模块方法对土壤微生物组进行高分辨率分析，从而提供有关土壤系统发育广度和功能能力的新知识。
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