科研 | 华南师范ISME ：宏基因组揭示了新型解磷菌在矿山退化土地生态恢复后的作用
编译：国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。
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尽管有许多研究旨在加强土壤磷的循环，但对陆地生态系统管理和恢复过程中土壤微生物磷（P）循环潜力的变化知之甚少。本文使用宏基因组测序分析了华南一个磷缺陷退化矿区的18个土壤微生物群落，其中使用两种土壤改良剂和八种植物实施了生态恢复。
结果表明：
(1)控制土壤微生物磷循环潜力的关键基因的相对丰度在恢复位点上高于未恢复位点，表明恢复后土壤磷循环增强。 gcd基因编码一种介导无机磷增溶的酶，在整个土壤样品中占主导地位，是生物利用土壤磷的主要决定因素。
(2)重建了39个包含gcd的近乎完整的细菌基因组，这些基因组代表了多种新型的可溶解磷酸盐的微生物类群。这些基因组的相对丰度与可利用的土壤磷之间存在很强的相关性，表明它们对促进土壤磷循环的贡献。
(3)此外，在39个基因组中的含gcd的支架中检测到84种可移动的遗传元件，为噬菌体相关的水平基因转移在协助土壤微生物获得与磷循环相关的新的代谢潜力中的作用提供了证据。
论文ID
原名：Novelphosphate-solubilizing bacteria enhance soil phosphorus cycling following ecological restoration of land degraded by mining
译名：矿山退化土地生态恢复后新型解磷细菌促进了土壤磷循环
期刊：The ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019.09
通信作者：李金天
通信作者单位：华南师范大学
实验设计
这项研究是在位于中国江西省九江市西南约22公里（北纬29°40′52″ N，东经115°49′21″）的一个严重退化的矿区中进行的。土地荒废了八年多，土壤仍然很酸（pH 2.5）。位于退化土地中心的约4000平方米区域已实施了生态恢复计划。简而言之，将修复的目标区域划分为20个地块，每个地块5×40 m，人行道之间的距离为1 m。在每块地上以10 cm的深度添加土壤改良剂（石灰：20 t /ha；鸡粪：40 t /ha），以改善植物生长的基质条件。鸡粪中总磷和可生物利用磷的浓度分别为18.5和1.03 g /kg（以干重计）。在种子或幼苗的改良尾矿上种植了八种植物的混合物。
采样分别于2016年7月和2017年进行，分别代表修复治疗实施后的3年和4年。在每个采样日期，随机选择三个填海区进行采样。在每个样地中，从再生尾矿的修正层（0-10厘米，ALRT）和未修正尾矿的未修正层（11-20厘米，ULRT）收集一个土壤样品。还从0到10 cm深度处的三个取样区的每一个旁边的未回收尾矿（UT）收集了一个土壤样品作为对照。总共收集了18个土壤样本，样本总覆盖面积约为144平方米。
结果
1增强土壤微生物磷循环潜力
在我们的元基因组中共检测到涉及土壤磷微生物转化的36个基因（图1）。它们可以大致分为以下三个子组：增溶作用（包括无机磷增溶作用和有机磷矿化作用），转运蛋白和调节基因。这些基因（包括gcd，phoD和phoA）中的大多数（大约70％）在ALRT中比在UT和ULRT中具有更高的丰度（P <0.05，图1），表明土壤微生物磷循环恢复措施极大地提高了严重退化土地的潜力。在这方面，由于两个原因，gcd基因是一个引人注目的例子。首先，gcd是导致退化土地上土壤微生物磷循环（尤其是磷增溶）的最主要基因之一，这支持了我们关于其优势的假设。其次，在两个采样日，ALRT中gcd的相对丰度分别是UT的183和289倍（图1）。值得注意的是，ULRT中几个编码CP裂解酶的基因（例如phnG，phnH和phnI）的相对丰度与ALRT中的相对丰度相当或更高（图1），这表明恢复措施提高了微生物CP的遗传潜力。不仅在ALRT中而且在ULRT中都具有裂解。
图1 生态恢复对负责土壤微生物P循环潜力的基因的相对丰度的影响。左图和右图分别显示了在生态恢复开始后第3年和第4年收集的土壤样品的数据（n = 3；平均值±标准误差）。 UT，ALRT和ULRT分别代表从未复原的矿山尾矿，复原的矿山尾矿的修正层（0-10厘米）和复原的矿山尾矿的未修正层（11-20厘米）收集的土壤样品。
2 土壤微生物磷循环潜力与土壤磷状况之间的联系
土壤磷的微生物更新涉及的所有基因的相对丰度与土壤磷的总浓度之间存在正相关（r = 0.87，P <0.001；图2a），这表明添加了富含磷的土壤鸡粪进入退化土地，激发了其土壤微生物磷循环的潜力。之所以做出这种推测，是因为石灰（本研究中使用的另一种土壤改良剂）往往会引起磷的沉淀，并且据报道经常会减少土壤磷的循环。此外，参与土壤磷微生物转化的所有基因的相对丰度也与生物利用土壤磷的浓度呈正相关（r = 0.76，P <0.001；图2b），表明增强土壤微生物的重要作用。在可生物利用的土壤磷积累中的磷循环潜力。随机森林分析显示，与36个磷相关的基因中有15个可以被认为是可生物利用的土壤磷浓度的决定因素（图2c）。值得注意的是，其中gcd最重要（图2c）。
图2 负责土壤微生物磷循环潜力的基因与土壤磷状况之间的联系。
显示了参与土壤微生物P循环的所有基因的相对丰度与总土壤P（a）或生物利用土壤P（b）之间的关系。图（c）显示了通过随机森林分析确定的可生物利用的土壤P的重要基因预测因子（P <0.05）。
3 新型的基因组箱驱动增强土壤微生物磷循环潜在
组装和装箱过程生成了424个微生物基因组箱，其完整度超过90％，污染小于5％（近完整基因组）。其中，有39个包含gcd基因（图3）。这些基因组代表了酸性细菌门（39个基因组中的12个），α-变形细菌类（7），β-变形细菌类（1），γ-变形细菌类（10），δ-变形细菌类（1），门生拟杆菌（5），芽孢杆菌科（2）和豆科（1）等多种细菌。值得注意的是，39个基因组中只有6个（即约15％）属于微生物属，具有先前已知的可溶解磷酸盐的分离物（图3），表明其他33个基因组代表了一系列新的磷酸盐溶解微生物分类群。39个基因组的gcd基因拷贝数差异很大，范围从1到11（图3）。具有先前已知的可溶解磷酸盐的分离物的属于微生物属的六个基因组均不包含超过两个拷贝的gcd基因。相比之下，发现代表新的可溶解磷酸盐的微生物分类群的33个基因组中的5个（例如binALRT3_3.63和ALRT4_1.19）分别具有五个以上的gcd基因（图3）。此外，与其他六个基因组相比，这33个新的基因组还倾向于具有更多的参与有机磷矿化的基因（例如phoD）（图3）。这39个个体基因组的相对丰度在样本类型之间差异很大（图3）。但是，以相对较高的丰度出现的绝大多数基因组是代表新的可溶解磷酸盐的微生物分类群的基因组（例如binALRT3_3.63和bin UT4_2.26，图3）。Spearman相关分析表明，所有39个基因组的相对丰度与土壤中的总磷（ρ=0.49，P = 0.02）和生物利用度（ρ=0.53，P = 0.02）正相关（图3）。此外，五个个体基因组（binALRT3_3.63，bin ALRT3_3.36，binALRT3_3.35，bin ALRT3_3.62和binALRT3_3.83）的相对丰度与生物有效性土壤磷的浓度呈正相关（r ≥0.70，P<0.01；图3），bin ALRT3_3.63是唯一一个与生物可利用土壤磷的相关系数>0.80的基因组（r = 0.83，P<0.01）。值得注意的是，所有五个基因组均属于属，而先前未鉴定出可溶解磷酸盐的分离株（图3）。
图3 分析了包含gcd基因序列的39个高质量的由元基因组组装的基因组。图左侧显示了使用PhyloPhlAn构建的最大似然系统树。
4 基因组箱中编码GCD的基因的多样性和系统发育
总共在39个含gcd的基因组区域中检测到89个编码GCD的基因（图4）。值得注意的是，大多数这些GCD蛋白与已公开的参考序列不同，并在树中形成了不同的簇（图4）。这些结果表明在这项研究中发现了许多潜在的新gcd基因。值得注意的是，这些推定的新基因广泛分布在与酸性细菌，拟杆菌，双歧杆菌，扁平菌和变形杆菌相关的各种分类单元中（图4）。然而，来自变形杆菌的GCD蛋白序列与来自其他三个门的GCD蛋白序列聚集在一起，这表明在某些细菌中gcd的获得过程中涉及了HGT（图4）。
图4 GCD的系统发育分析
讨论
作为生态和进化因素，磷被认为会覆盖所有其他元素，包括C和N。然而，尽管最近以基因组为中心的宏基因组学在理解微生物缺乏土壤基因组C和N循环的重要作用方面取得了重大进展，但文献报道很少有由基因组组装的基因组编码负责土壤磷循环的酶。在这里，我们从一个生态修复项目相关的18个元基因组中重建了39个近乎完整的基因组，参与了土壤磷循环，这使我们能够推断出某些先前未知的磷酸盐增溶细菌是恢复后土壤磷循环增强的主要驱动力。。此外，我们获得了证据，表明土壤微生物可以通过噬菌体相关的HGT机制来塑造新的磷相关的代谢潜力。
结论
某些未知的磷酸盐溶解细菌（如gcd基因的出现），以前不知道具有能够溶解磷酸盐的分离物，这些细菌在恢复严重退化的土地后恢复土壤磷循环的过程中起着重要作用。此外，噬菌体相关的HGT可能参与其中某些细菌中gcd的获得。鉴于已经报道了gcd在各种类型的土壤中普遍存在，我们的发现对于理解许多其他陆地生态系统中的土壤磷循环下的微生物机制可能具有重要的意义。
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