编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
表层土壤通过甲烷氧化细菌氧化作用吸纳大气中的甲烷，而草原和森林的过度开垦利用可能会降低土壤对甲烷的吸纳能力。本研究考察了草地利用强度（150个站点）和森林管理方式（149个站点）对表层土壤潜在甲烷氧化速率（PMOR）和甲烷氧化细菌（MOB）丰度及多样性的影响。通过测定微宇宙实验环境中的甲烷氧化速率发现，森林土壤中的甲烷氧化量大约是草地土壤的两倍。高强度的土地利用对甲烷氧化速率存在消极影响（-40%），施肥是其中的主导因素（导致PMOR下降20%）。相比之下，森林管理方式对土壤PMOR没有影响。森林土壤中甲烷氧化细菌以USC-α为主，而USC-γ只存在于不到一半的森林土壤样品中，却存在于几乎所有草地土壤样品中。USC-α丰度与森林土壤的PMOR呈正相关，而草地土壤中USC-γ对PMOR的贡献大于USC-α。土壤容重对草地和森林土壤的PMOR均有负面影响。研究还发现，PMOR对pH、土壤质地、土壤持水量和有机碳氮含量的响应在温带森林土壤和草地土壤之间存在差异。pH对PMOR无直接影响，但可以通过改变甲烷氧化细菌丰度间接作用于甲烷氧化速率。结果表明，减少草地利用强度并进行植树造林能够增加土壤吸纳甲烷的能力，pH等各种环境条件也对森林和草地中土壤微生物的甲烷氧化能力有一定影响。
原名：Divergent drivers of the microbial methane sink in temperate forest and grassland soils译名：温带森林和草原土壤中微生物吸纳甲烷沉降的不同驱动因素
土壤样品取自于德国西南、中部和东北部三个不同气候区，每个区域选择50个草地（50m×50m）和50个森林站点（100m×100m）。不同站点土壤类型不同：草原可分为为草甸、牧场或刈割草场。每年对放牧强度、施肥和刈割频率进行监测，并计算2016年每个站点的土地利用强度指数（LUI）：标准化放牧强度（每年每公顷放牧天数）、每年割草次数和每年每公顷施氮量三者之和的平方根，然后要根据其在所有地区的平均值来进行标准化。在林区，树种主要为山毛榉、云杉、松树或橡树。森林管理指数（ForMI）是根据非本地树种比例、收获的树木生物量和有锯切迹象的枯木比例所计算出来的。2017年5月对所有299个地点进行了采样，每个地块采集一个混合土壤样品，取样前先去除土壤上的有机层和植被。样品过筛后（< 5mm）一部分于4°C保存，用来测定甲烷氧化潜势；一部分于-20°C保存，用来提取DNA和测定土壤理化性质。将3-6克土壤于105°C烘干至恒重，测定土壤水分含量。将10g风干过筛的土壤与25 ml 0.01 M CaCl2溶液混合，用玻璃电极pH计测定悬浮液的pH值。风干土壤样品经球磨机研磨后，用元素分析仪测定其总碳和总氮含量。将土壤样品在450℃下燃烧16 h去除有机碳后，用元素分析仪测定无机碳含量，总碳与无机碳的差值即为有机碳含量。用0.5 M K2SO4提取铵态氮和硝态氮，振荡并离心后用紫外光谱分析仪测定提取态氮含量。
测定299个土壤样品（每份三个平行）在微宇宙环境中的甲烷氧化潜势(PMOR)：新鲜土壤装入塑料容器中，调整含水量为各自土壤最大持水量的34%，于20℃温育5天。将装有土壤的塑料容器放入玻璃罐中，密闭后在20℃黑暗条件下培养。通过调节三通阀用注射器采集0、1、2、6h时间点的气体样品各12 ml装入真空瓶中，用气相色谱仪测定甲烷浓度并计算甲烷氧化潜势。提取土壤DNA后于-20°C保存待用，从不同地区和土地利用类型的土壤样本中选出部分甲烷氧化潜势不同的土壤DNA样本对其中pmoA/mmoX基因进行定量以分析相关甲烷氧化菌群。用qPCR对三类基因进行了定量分析：用pmoA定量所有甲烷氧化细菌，用FOREST定量USC-α型pmoA，用GAM定量USC-γ型pmoA。用R软件进行数据处理：检验数据的正态分布和方差齐性，正态分布数据采用T-test，非正态分布数据采用Mann-Whitney检验组间显著性差异。草地被分类为高利用强度、低利用强度、高放牧强度和低放牧强度几种类型，用线性回归法分析PMOR与理化性质和土地利用情况之间的关系，用结构方程模型解释其对甲烷氧化潜势的直接或间接作用。假设森林和草地土壤理化性质（容重、pH等）和土地利用强度一方面直接影响PMOR，另一方面通过作用于甲烷氧化细菌丰度间接影响PMOR。
1 土地利用及土壤性质对PMOR的影响
299个表层土壤样品中均检测到对大气中甲烷的吸收，各地区中森林土壤的甲烷氧化潜势均显著高于草地土壤（图1）。森林土壤PMOR在不同区域间差异不大，而草地土壤PMOR在三个采样区域之间有所不同，这可能与地区间土壤类型和质地的多样性有关。不同质地的森林土壤之间PMOR无显著差异，而草地土壤的PMOR在壤质黏土和壤质粉土中较高，在粉质黏土和砂质壤土中较低。在粉质黏土和砂质壤土中，森林土壤的PMOR高于相似质地的草地土壤。
图1 草地和森林土壤的甲烷氧化潜势。
森林土壤的PMOR与ForMI及其相关参数都不相关，而优势树种对PMOR有显著影响：橡树林的土壤样品中PMOR最低，山毛榉和云杉森林土壤样品的PMOR最高 (图2)。与不受利用方式影响的森林相比，草原的LUI与PMOR呈显著负相关。高LUI的草地土壤中PMOR比低LUI草地土壤减少了约40%（图3a）。就同样利用强度的草地来说，施肥使PMOR降低了约20%（图3b）。总体来说，放牧强度和割草频率对PMOR没有显著影响（图3 c，d）。铵态氮含量在未施肥土壤中高于施肥土壤，而硝态氮含量在施肥土壤中较高。
图2 森林中不同树种对甲烷氧化潜势的影响。
图3 草地中土地利用情况对甲烷氧化潜势的影响，（a）土地利用强度指数（b）施肥（c）放牧（d）割草。
对于森林土壤样本，PMOR与持水量、有机碳和全氮含量均不相关，但与土壤容重呈显著负相关。在pH较低的地区，pH与PMOR呈正相关；而在pH较高的地区，pH与PMOR呈负相关。与森林土壤相反，草地土壤中PMOR与土壤有机碳和总氮含量呈正相关。对于所有草地土壤样品来说，PMOR随土壤持水量的增加而增加，随土壤容重增加而降低，且与NH4+和NO3-浓度呈正相关。
2 土地利用及土壤性质对MOB的影响
在预选的30个表层土壤样品中，通过PCR未检测出属于Verrucomicrobia或Methylocella的甲烷菌，因而并未对299个土壤样本进行这些检测。多数样品中都有检出USC -α和USC-γ类型的甲烷菌，但在不同土地利用类型（森林与草原）和不同区域中的丰度有所不同（图4）。USC –α存在于所有森林土壤样品中，但仅存在于56%的草地土壤样品中；USC-γ存在于所有草地土壤样品中，但仅存在于30%的森林土壤样品中。总体来看，森林土壤中USC-α型pmoA基因丰度的中位数约为草地土壤中的100倍；相反，USC-γ在草地中的丰度约为森林土壤中的100倍。但若仅就某一地区来看，差异就没有这么大了。
图4 不同地区草地和森林土壤中USC -α和USC-γ型pmoA基因丰度。
USC -α基因丰度在橡树和松树森林中相对较高，而在云杉和山毛榉树林中较低；相反，USC -γ基因丰度在山毛榉和云杉树林中更高。USC -α与ForMI间无相关性，但与收获的树木生物量之间呈负相关关系。USC-γ与ForMI、非本地树种和收获的树木生物量呈正相关关系。在草地土壤中，USC-α或USC-γ的丰度与LUI之间没有相关性，LUI的高低及其组分并不影响土壤样品中的USC-α和USC-γ拷贝数。
3 土地利用及土壤性质对MOB和PMOR的综合影响USC-α和USC-γ型 pmoA基因拷贝数对土壤理化性质的响应有所不同：森林土壤中USC-α基因拷贝数与有机碳呈负相关，而USC-γ丰度与有机碳和氮含量呈正相关。USC -α与pH值负相关，而USC –γ与pH值呈正相关。草地土壤中USC-α和USC-γ型pmoA基因丰度与NO3 -含量无显著相关性。森林土壤中USC-α型pmoA丰度与PMOR呈正相关，但USC-γ与PMOR之间无相关关系。而在草地中，USC-α与PMOR之间无相关关系，USC -γ与PMOR呈正相关（图5）。森林土壤中PMOR与MOB的相关性比在草地土壤中低。
图5 （森林土壤中）USC –α和（草地土壤中）USC-γ型pmoA基因与甲烷氧化潜势的皮尔森相关关系。不管是在森林还是草地土壤中，土壤容重都对PMOR有较强的负面作用（图6）。pH通过改变MOB丰度（抑制USC-α并促进USC-γ）间接影响PMOR。森林管理方式不影响PMOR，但草地利用强度总体上对PMOR存在直接负面作用，也通过改变USC-γ丰度间接影响PMOR。MOB丰度能够直接影响PMOR：在森林土壤中，USC-α丰度对PMOR有很强的直接正向影响，而USC-γ对PMOR没有直接影响（图6a）。而在草地土壤中，USC-α和USC-γ均对PMOR有直接的正向作用，其中USC-γ的作用强于USC-α（图6b）。
图6 结构方程模型展示了土壤理化性质和土地利用强度对甲烷氧化潜势的直接和间接作用，黑色实线为显著正效应，红色实线为显著负效应，灰色虚线为效应不显著。
森林土壤PMOR一般比草地土壤高2倍左右，这与对不同生境中PMOR的荟萃分析相一致，后者发现森林中的PMOR比其他生态系统高2.5倍，比草地生态系统高2倍。本研究的PMOR是原位甲烷通量的1.5-2倍，这可能是由于选取了PMOR最大的表层土壤，并调整水分含量至其氧化甲烷的最佳值。通过将土壤含水量等理化参数标准化，可以更好地分析各种驱动因素对PMOR的影响。测得的MOB丰度和标准化的PMOR可以反映MOB动态变化和土壤对甲烷的吸纳能力。温度和降水对甲烷氧化均有影响：高温和中等含水量的土壤中甲烷吸纳能力最高。不同地区的草地土壤中PMOR存在差异，而森林土壤中PMOR无差异。由于同一区域内草地和森林站点的总体气候条件比较相似，各地区的平均气温差异很小，这说明气候差异并不能解释这三个区域草地间PMOR的差异。年平均气温和降雨量与大气中甲烷氧化的相关性很弱，所以不同地区之间温度和降水的差异不足以引起PMOR的变化。草地土壤中PMOR的变化可能是由土壤性质等其他因素引起的，土壤密度较高的地区可能导致PMOR较低。通过扫描电镜的分析发现，土壤容重对PMOR存在负面影响。有趣的是，许多与草地中PMOR相关的因子与森林土壤中PMOR并不相关。在草地土壤中，PMOR随土壤持水能力的增加而增加，而森林土壤的持水能力对PMOR无显著影响。生态系统类型是PMOR的重要驱动因子，其对土壤理化性质的响应也取决于生态系统类型。森林地表的有机层可以减少土壤中甲烷的氧化，是甲烷扩散的物理屏障，而本研究中有机层的厚度对PMOR并无显著负面影响，甚至有些地方有机质层对甲烷氧化有轻微的促进作用。土壤容重和pH对甲烷氧化均有影响：PMOR一般随容重的增加而降低，土壤容重越高则孔隙度越低，可能导致气体扩散能力减弱从而降低土壤中甲烷的氧化速率。值得注意的是，采样场地的原始容重在土壤经过筛压实后进行微宇宙培养实验的情况下，仍然对甲烷氧化有影响。森林和草地土壤的PMOR对pH的响应不同：森林土壤PMOR的最优pH约为4，而多数草地土壤样品中PMOR随pH增加而增加。森林土壤在pH值3-7.5范围内都表现出甲烷氧化能力，草地或耕地土壤中甲烷氧化作用随pH降低而减弱。pH对甲烷氧化的影响在不同生态系统中有所不同：森林土壤中甲烷氧化过程偏好弱酸性环境，而草地土壤中甲烷氧化过程偏好中性环境。pH主要通过影响两种甲烷氧化细菌丰度来间接作用于PMOR，这意味着森林和草地土壤中不同的MOB类群具有不同的pH偏好性。草地土壤中PMOR的变化幅度明显大于森林土壤，且在不同区域间存在差异性。森林土壤的PMOR普遍高于草地土壤，表明森林生态系统在各种土壤环境条件下对甲烷具有更强的吸纳能力。通过测定299土壤样品中的MOB丰度，进一步研究了MOB与土壤理化性质和PMOR之间的关系。森林土壤中USC-α型pmoA丰度与PMOR呈正相关，但多数草地土壤中未检出USC-α基因。相反，USC-γ型pmoA普遍存在于草地土壤中且与PMOR呈正相关，但在森林土壤中未检测到USC-γ。土壤pH值是USC-α和-γ基因丰度最重要的预测因子，USC-α偏好酸性土壤，而USC-γ偏好中性土壤。因而，森林的低pH值和草地的中性pH值或可解释这两种USC的分布模式。森林土壤单位生物量的PMOR低于草地土壤，这可能是由于其中微生物群落的不同所造成的。单位生物量的PMOR也可能会受到气体扩散的影响：容重较高土壤中气体扩散较难，可能需要多微生物来实现同样的PMOR。草地利用强度对PMOR有负面影响：结构方程模型显示，LUI在各区域均存在直接的负向效应。施肥土壤的甲烷氧化速率比未施肥土壤低20%，而在施肥集约化管理较差的地区，LUI对PMOR无显著影响。肥料中的铵离子可以抑制甲烷单加氧酶的活性，但在施肥土壤中未检测到较高的铵离子浓度。这主要由于土壤中的铵态氮浓度是动态变化的，取样时的铵态氮浓度可能无法反映其年平均浓度。长期施肥也可能对土壤微生物产生影响，这里施肥没有影响甲烷氧化细菌的丰度，但却影响了PMOR。高LUI（包括施肥、放牧和刈割）的草地土壤中PMOR比低LUI的草地土壤降低了40%，放牧和割草导致PMOR的降低或可归咎于动物踩踏和割草机造成的土壤压实作用。然而，只有在结合施氮肥的情况下，土壤压实才会降低其甲烷氧化作用。过度放牧减少了向土壤中渗入的水分，也改变了气体向土壤中的扩散。施肥对PMOR的负面影响在不同土壤类型中均有所体现，通过降低土地利用强度（尤其是减少施用氮肥），温带草地吸纳甲烷的能力或可有所提高。优势树种对森林土壤的PMOR有一定影响：山毛榉林和针叶林(松树或云杉)之间并无显著差异，而橡树林土壤的PMOR低于山毛榉林。在以橡树为主的森林中，USC-α丰度和土壤呼吸速率也比较低，表明土壤中存在抑制微生物活动的物质。但不同研究间的结论很不一致，可能优势树种单独并不对PMOR构成重要影响。不同树林中，土壤理化性质对甲烷氧化的影响也有很大差异：较高的含水量增加了云杉土壤中的甲烷氧化速率，但却降低了松树林土壤的甲烷氧化速率。就某一特定树种而言，可能要在最优的土壤理化性质条件下，才能够最大限度地进行甲烷氧化。森林土壤是大气甲烷的一个重要的汇，不怎么受土壤理化性质和管理措施的影响。由于森林土壤对甲烷的吸纳能力高于草地，因而植树造林有利于甲烷沉降于土壤，减少大气中甲烷浓度，从而缓解温室效应。森林土壤和草地土壤中微生物的甲烷氧化能力不同，森林土壤强大的甲烷吸纳能力不易受土壤理化性质的影响，而草地则恰恰相反。较高的草地利用强度（尤其是施肥）不利于土壤中微生物对甲烷的氧化，而不同的森林管理措施对PMOR没有影响。因此，减少草地利用强度和植树造林可以增加土壤对大气中甲烷的吸纳能力。此外，USC-α和USC-γ的分布与土地利用类型有关：森林土壤中主要为USC-α，而草地中以USC-γ为主。森林土壤的PMOR与USC-α丰度正相关，而草地中PMOR与USC-γ正相关，所以USC-α是森林土壤中氧化甲烷的主要微生物类群，USC-γ是草地土壤中负责吸纳甲烷的关键微生物。
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