易基因 | 学科前沿：转录组测序在原核生物研究中的应用（2）｜文献科普
易点评
最近有研究表明，在多细胞真核生物的发育转录本中存在着系统发育和个体发育的相关性。同时，人们逐渐认识到多细胞行为是细菌生物膜形成的基础。然而，目前还不清楚细菌生物膜的生长是否与复杂真核生物的发育有一些共同的基本原理。因此，为了揭示枯草芽孢杆菌生物膜的发育机制，作者利用转录组和蛋白质组测序，发现了生物膜个体发育与进化的方式相关。分子和形态学特征也揭示了生物膜的生长受到进化程度的调控，并被分成了不同的个体发育阶段，这表明芽孢杆菌中的生物膜形成是一个真正的发育过程，类似于动物、植物和真菌的有机体发育。
介绍
多细胞行为在细菌中广泛存在，有人认为它们应该被认为是多细胞有机体。然而，由于实验室广泛使用针对多细胞行为驯化选择的细菌模型，以及缺乏细菌和多细胞真核生物之间系统水平上的共性的证据，这一想法可能还没有被普遍认同。近期开发的用于跟踪动物发育进化特征的Phylo转录工具被用来应用于植物和真菌发育过程的分析。虽然真核生物多样性的三个主要分支的发育是独立进化的，但它们的个体发育却显示出了相似的系统发育-个体发育关系，这表明可能所有的真核发育程序都有进化印记。
枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)NCIB3610是细菌生物膜研究中常用的模式生物，表现出许多在多细胞真核生物中才具备的特性，包括细胞分化、细胞信号转导、形态发生、细胞程序性死亡和自我识别等。枯草杆菌生物膜的这些特性通常被视为独立细胞的集体行为，或者视为多细胞个体的组织特征。作者采用了后一种观点，通过应用系统转录组学将生物膜作为一个单独的有机体来处理。作者找到了一组合适的全基因组基因表达数据，它覆盖了整个生物膜生长过程的全部个体发育阶段，并对整个生物膜进行了相对密集的时间采样。在所有的细菌物种中，这种纵向的生物膜研究相对较少，而且已有的研究只涵盖了生物膜生长的初始阶段。因此，作者通过对生长在固-气界面上的枯草杆菌NCIB3610生物膜进行采样，构建了一个新的表达数据库。
结果
生物膜的生长是一个组织阶段性过程
为了测量枯草杆菌生物膜形成过程中转录组的表达水平，作者对11个时间点进行采样，覆盖了从接种到2个月龄的整个个体生物膜发育过程(图1a)。作者用RNA-seq技术测定了4316个(96%)枯草芽孢杆菌基因的表达量，揭示了生物膜在个体发育过程中的三个不同时期：早期(6H-1D)、中期(3D-7D)和晚期(1M-2M)，并由2D和14D这2个过渡阶段相连(图1)。生物膜转录结果显示了时间分辨的主成分分析(PCA)(图2)与接种生物膜的液体培养基(LC)的相关性(图1b)，结果表明生物膜在枯草芽孢杆菌生活史中占有重要地位。当作者将所有个体发育时间点考虑在内时，有4,263个(99%)基因发生差异表达，当作者排除了生物膜生长停滞的起始点LC和晚期时间点(1M-2M)只观察严格意义上的生物膜生长时期(6H-14D)时，产生表达差异的基因数量基本一致(4190个基因，97%)。当作者只保留表达变化2倍或更高的基因时，差异表达基因的数量仍然很高：2546个基因(59%)在广义的生物膜生长中，2798个基因(65%)在严格意义的生物膜生长中。这些数值反映了生物膜在个体发育中转录的高度动态调节，这与动物胚胎中观察到的现象相同。在连续的个体发育时间点之间进行成对比较发现，大多数基因(约70%)在生物膜接种(LC-6H)时发生了转录改变，这表明从LC平板到固体琼脂平板的转变代表了枯草杆菌生活方式的突然改变。生物膜生长过程中最活跃的两个阶段是1D-2D和7D-14D的转换，其中分别有约30%和25%的枯草芽孢杆菌基因发生转录水平改变。连同相关性(图1b)、PCA(图2)和聚类分析(图1c)，这表明生物膜生长过程中基因的表达不是一个连续的过程。相反，就像动物的发育一样，它被不同的个体发育阶段(早期、中期和晚期)的转录变化所分隔开。
进化的表达方式呈现出一种重演模式
为了评估生物膜的生长是否具有一定的进化方向性，以及这个过程是否是宏观进化的微观体现，作者将转录组数据与进化基因的年限联系起来，以获得转录组年龄指数(TAI)，这是一个累积的衡量标准，给出了表达的mRNA库的总体进化年龄。如果人们假设生物膜个体发育中的表达模式与基因的进化年龄无关，那么TAI图谱应该显示出一种接近平坦的趋势；也就是说，TAI和个体发育没有相关性(图1d)。在枯草杆菌中，作者发现了一种重复模式，其中生物膜生长的早期时间点表现出进化年限较久远转录本，而中晚期转录本则表现时间较近的转录本(图1e)。生物膜时间点(个体发育)和TAI(系统发育)之间的这种相关性表明，就像在复杂的真核生物中一样，宏观进化逻辑在枯草杆菌生物膜的形成中起着一定作用。作者还研究了TAI图谱与基因进化年龄(Phylostrata-PS)的关系，发现从Firmicuts(PS4)起源起，重复模式就已经存在了，反映了它在细菌系统发育中的相当重要的作用。
mRNA转录调控是基因表达的重要环节。然而，只有在蛋白质翻译之后，才能获得可供选择的全分子表型。在像个体发育这样的非稳态过程中，过多的干扰因素影响着mRNA和蛋白质的表达水平，导致它们的相关性相对较低。为了检验重演模式是否也存在于蛋白质组水平，作者对具有代表性的阶段(LC、12H、1D、2D、7D)的蛋白质组进行了测定，这些蛋白质组涵盖了宏观形态变化中最动态的部分。作者获得了2907个(67%)蛋白质表达值，并用它们来计算蛋白质组年龄指数(PAI)，这是一个类似于TAI的累积度量，给出了蛋白质库的总体进化年龄。尽管转录组和蛋白质组水平在时间点和个体发育之间的对应程度相对较低，但PAI图谱也显示了一种显著的重复模式，在生物膜个体发育过程中，进化程度较高的蛋白质在早期和后期有较高的表达(图1g)。这表明，除了转录本外，在生物膜蛋白质组中也可以看到系统发育和个体发育的相互依赖性。
多细胞重要基因在中期生物膜中的主导作用
为了进一步发现生物膜生长和多细胞发育之间的相似之处，作者研究了转录因子和细胞-细胞信号基因的表达模式，它们是复杂真核生物中定义发育特征的基因。作者发现枯草杆菌转录调控因子在生物膜发育中期(2D到7D)中的转录累积最高，并且在这一时期几乎所有的转录水平都在其总表达谱的中位数以上(图3a)。即使作者把分析范围缩小，这一点也是成立的(图3b)。同样，群体感应基因在3D时转录达到峰值(图3c)，这表明在生物膜获得了典型皱纹形态的时间点上，细胞间进行了精准的通讯(图1a)。蛋白质磷酸化是真核生物和细菌参与细胞信号传递和分化的另一个重要机制，在枯草杆菌生物膜的形成过程中起着关键作用。作者再次发现，蛋白磷酸化基因(激酶和磷酸酶)在中期生物膜中的累计转录水平达到最高(图3d和e)，这可能反映了该生长阶段的各种类型的细胞分化。动物发育的另一个特征是胚胎中期时间多效性基因的丰富。作者在枯草芽孢杆菌中选择了不同截止点的时间多效性基因，并观察了它们在生物膜个体发育过程中的累积使用情况。作者发现，时间上的多效性基因倾向于在中期生物膜中表达，这进一步证实了中期发育在枯草杆菌生物膜生长中的中心作用。
枯草杆菌基因的功能注释，包括生物膜形成基因的调控网络，在质量和完整性方面都相对先进。这使作者能够跟踪关键生物膜基因的表达，并分析生物膜个体发育中的特定功能模式(图3f和图4)。从总体上看，关键生物膜基因从生物膜形成的初期(6H)开始转录增加，在早期和中期保持高值，并在晚期生物膜中逐渐下降(图3f)。
这些表达模式在很大程度上遵循了生物膜发育的生化网络方面的相关规律，但作者的研究结果也提供了新的见解，特别是与生物膜生长的后期阶段有关。14D时表面蛋白表达的激增可能与这个时间点附近生物膜边缘观察到的滑动运动有关。另一个例子是铁的动态平衡，它与生物膜的形成密切相关。作者恢复了这一过程完整的转录动力学，发现铁载体相关途径基因的表达呈双峰型，在生物膜早期到中期(12H-2D)和生物膜晚期(14D)表达量达到峰值。在14D的第二个高峰之前，铁解毒基因的表达最高。所有这些都表明，生物膜生长的后期，类似于动物个体发育，表现出高度特异性的表达动态，这一部分还没有得到充分的研究。
生物膜生长具有阶梯式的功能结构
生物膜生产时间点的功能类别富集分析揭示了一个严格的调控过程，其中每个时间点表示一个特定的功能单元(图4)。一些例子包括PBSX原噬菌体(eDNA生产)、早期生物膜中的抗菌化合物的产生(6H-12H)、1D阶段的锌代谢、铁载体的铁吸收、3D阶段的群体感应、中期的孢子形成和毒素/抗毒素的产生(2D-14D)、过渡期14D的一般胁迫以及晚期生物膜中的可移动遗传元件(1M-2M)。2D阶段缺乏功能注释的基因的丰富可能反映了对控制生物膜早到中期转变的分子机制的不完全了解。对这些基因进行进化分析发现它们优先起源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ps10-ps12菌株。这与动物的发育类似，在动物中，系统发育受限的基因参与了胚胎过渡和形态多样性的产生。总体而言，功能富集分析表明，与单纯的转录图谱相比，功能水平上的生物膜生长基因具有层级组织，时间分级(图1b和图4)。生物膜生长的这种模块化性质类似于动物发育的不连续和阶段性的组织结构。
结论
多细胞并不是罕见的进化转变，因为它已经在不同的谱系中独立进化了许多次。然而，在每一个独立的进化事件中，它似乎都受到一些类似的基本原则支配，其中包括宏观进化的印记。未来的研究工作应该明确那些已发现的细菌和古细菌的多样性以及包括微生物群落生物膜在内的生态条件方面的普遍性。然而，作者的研究结果初步证实了细菌和古细菌多细胞行为的普遍性，以及第一批化石是细菌生物膜的事实，鼓励并呼吁人们重新评估“地球上的第一个生命是单细胞”这一被广泛接受的观点。毫无疑问，细胞是生命的基本单位；然而，这并不意味着第一个生命是单细胞的。至少有一些模型设想，原始细胞是以生物膜样结构组织起来的，生命周期中的单细胞可以作为早期海洋中一种生命体并进行进化。